[发明专利]冢村氏菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种冢村氏菌环介导等温扩增快速检测方法，本发明针对冢村氏菌16s rDNA基因保守序列的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温65℃左右，几十分钟即可实现核酸的高效扩增；4条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性；LAMP不需要模板的热变性，长时间温度循环，在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的浪费，使反应速度可提高30‑50％；反应结束后，可直接通过肉眼观察反应管颜色变化，或通过凝胶电泳判断检测结果；该技术对冢村氏菌的检测特异性强，具有快速、高效、仪器要求简易、操作简便，成本低，易于在基层推广使用的特点。同时，本发明首次设计、筛选到冢村氏菌LAMP检测引物，并建立了冢村氏菌LAMP检测方法，填补了国内外在此检测领域的空白。

技术领域

本发明属于医学分子生物学诊断技术领域，涉及一种采用环介导恒温核酸扩增技术对冢村氏菌进行检测的方法和试剂盒。

背景技术

冢村氏菌属(Tsukamurella)在细菌分类学上属放线菌目，是生长缓慢且具有弱或不定抗酸性的专性需氧革兰氏阳性不规则杆菌，迄今为止已发现13种，其中7种与人类疾病相关。冢村氏菌属主要侵袭免疫力低下人群，该属微生物感染与慢性肺部疾病、免疫抑制(白血病，肿瘤，HIV/AIDS感染)以及术后伤口感染有关。

冢村氏菌属与含分枝菌酸的其他物种如放线菌目中的红球菌属、诺卡菌属、戈登菌属和分枝杆菌属等有许多共同的表型特征，因此在标准的生化试验中可能被误判。冢村氏菌属感染患者多见慢性呼吸系统症状，与肺结核相同，其临床表现容易与结核分枝杆菌感染引起的肺结核病混淆，不易鉴别。临床上经常将冢村氏菌感染误诊为结核杆菌感染，这不仅会影响患者的诊断与治疗，也会导致疫情资料的错误。因此，在临床诊断中，快速鉴定冢村氏菌属感染对于病人的治疗、医院的传染病防治都至关重要。

目前国际上对于冢村氏菌的诊断主要基于生化检测、限制性酶切片段分析及16rRNA测序。其中，传统的生化检测对于冢村氏菌的检测需要排除在生化性状上极其相似的其它属，并且要经过数目众多的一组反应才能确诊，而且在某些情况下结果并不准确，容易误判。由于该菌生长缓慢(约1周)，且生化反应所用时间长，种类多，使得对该致病菌的检测效率低下，完全确诊需要2-3周时间，应用受到限制。而以分子生物学PCR为基础的限制性酶切片段分析及新近发展起来的测序技术均需要复杂的仪器设备和技术要求，价格高昂，不利于推广普及。

环介导基因恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification ofnucleic acid,LAMP)是一种新型恒温基因扩增技术，其特点是针对靶基因的六个独立区域设计两对特殊内、外引物，同时利用Bst脱氧核苷酸聚合酶启动循环链置换反应，完成核酸扩增。该技术在扩增反应前向体系中加入荧光指示剂，可直接通过肉眼观察结果，具有快速、简便、敏感性和特异性高、检测范围广等优点，而且扩增只需单一的恒定温度，不需要专门的扩增和检测仪器即可实现现场高通量快速检测，具有比常规PCR技术更广泛的应用前景。近年来，该技术已逐步应用于病原微生物的检测，但目前尚未见该方法用于冢村氏菌的检测，更无合适高效的引物用于该领域的LAMP检测。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题，提供一种速度快、灵敏度高、特异性检测冢村氏菌的LAMP检测用引物及检测方法。

本发明通过以下技术方案实现的：本发明根据冢村氏菌属16S rDNA基因的保守序列，设计了冢村氏菌LAMP特异性引物，确定反应条件和试剂浓度并进行优化，建立了冢村氏菌的LAMP快速检测体系，此方法对冢村氏菌的检测特异性强，1h即可获得检测结果，具有快速、高效、简易的特点。

本发明提供了一种建立冢村氏菌的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤。

(1)提供一套用于检测冢村氏菌的LAMP反应特异性引物序列，具体的寡聚核苷酸序列为：

F3:5’-GCCTGGGAAACTGGGTCTA-3’