[发明专利]一种基于金纳米簇的荧光猝灭与恢复检测端粒酶的方法

说明书

本发明公开了一种基于金纳米簇的荧光猝灭与恢复检测端粒酶的方法，通过加入Cu²⁺将BSA@AuNCs的荧光猝灭，再加入焦磷酸后，焦磷酸与Cu²⁺结合，将Cu²⁺从BSA@AuNCs中置换下来，使BSA@AuNCs的荧光恢复，通过检测BSA@AuNCs的荧光猝灭及恢复来检测PPi的含量，从而间接地检测端粒酶的含量，本发明采用Cu²⁺置换的方法，能够高效、灵敏的检测端粒酶的含量。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种基于金纳米簇的 荧光猝灭与恢复检测端粒酶的方法。

背景技术

金属纳米簇是由几个到几十个金属原子组成的、尺寸接近电子费米波长 的一类新型纳米材料。由于超小的尺寸，因此表现出不同于其他较大纳米粒 子的特殊性质，因此金属纳米簇具有诸多不同于其他较大纳米材料的优良性 质，使其在离子和生物小分子检测、酶活性检测、生物标记、生物成像、催 化及太阳能电池等领域有着广泛的应用。

众所周知，焦磷酸离子(P₂O₇^4-，PPi)在工业生产中具有广泛的应用，例 如可以作为电池的饿电极材料或者某些溶剂的催化剂。更重要的是当PPi的浓 度过高时，会造成环境的污染，如：某一种生物的暴涨会使其他生物死亡， 及某种生物数量的减少会令如氧等资源的缺乏等(参富营养化)。在人体中 则会影响人体的身体健康。据报道人体中健康的PPi生理浓度为3μM，一些 疾病的产生与PPi浓度密切相关，例如：焦磷酸钙的增多，通常会使患者出现 骨关节疾病或者假痛风等症状。因此，无论是生态环境还是人体环境，对于PPi的检测都是至关重要的。

人体端粒酶(Human telomerase)是一种核糖核蛋白酶，能够在端粒的3’ 端持续不断地产生(TTAGGG)重复序列，使端粒不停的生长，为DNA复制提 供大量的模板。在多数正常的人体细胞中，随着细胞的分化，端粒会缩短， 因此端粒酶的活性会受到抑制。与之相反，在肿瘤细胞中，端粒酶会过度表 达，它可以使端粒拉长，使细胞进行无限的增殖。

目前，端粒酶活性检测的方法中经典的方法是基于聚合酶链式反应(PCR) 的端粒重复序列扩增法(TRAP)。但是该方法需要先将端粒酶延长产物通过在 引物和反向引物混合核苷酸以及热启动聚合酶存在时利用聚合酶链式反应通 过一系列循环进行扩增，使目标物的浓度增大，然后再利用聚丙稀酰胺凝胶 电泳和染色方法分析结果，操作过程繁琐复杂，条件摸索困难，费时费力， 同时需要用到多种试剂，这些都很容易使实验结果中出现假性信号，导致实 验结果不是很可靠。因此，研究一种高效、灵敏的检测端粒酶的含量是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种高效、灵敏的检测端粒酶的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基于金纳米簇的荧 光猝灭与恢复检测端粒酶的方法，包括以下步骤：

(1)金纳米簇的制备：将HAuCl₄溶液加入到BSA溶液中，搅拌5-10min， 将NaOH的水溶液加入上述混合液中，调节pH为11-12，持续搅拌；将得到 的产物冷却至室温，装进透析袋中，透析过夜，过葡萄糖凝胶过柱得到 AuNCs@BSA，备用；

(2)Cu²⁺的猝灭：将反应制得的金纳米簇用水稀释，向AuNCs@BSA中加 入Cu²⁺溶液，加入Tris-HCl缓冲溶液，室温反应，得到被Cu²⁺猝灭后的 AuNCs@BSA，使用荧光分光光度计检测AuNCs@BSA的荧光强度；

(3)PPi的恢复：将PPi逐级稀释成不同浓度，加入被Cu²⁺猝灭后的 AuNCs@BSA溶液中，加入Tris-HCl缓冲溶液，混合均匀后，室温反应8-12min 后，进行荧光强度检测。