[发明专利]一种草鱼IgM单克隆抗体、其制备方法及其应用

权利要求书

1.一种草鱼(Ctenopharyngodon idellus)IgM单克隆抗体，其特征在于，所述草鱼IgM单克隆抗体由保藏号为C2017130的杂交瘤细胞株产生；该杂交瘤细胞株的获得过程包括如下步骤：

1)多肽合成与偶联：

以草鱼IgM重链区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示为基础，筛选出3条多肽序列：CIgM-HC1，其序列如SEQ ID NO.2所示；CIgM-HC2，其序列如SE Q ID NO.3所示；CIgM-HC3，其序列如SEQ ID NO.4所示；

根据3条多肽的序列进行人工合成及纯化；人工合成过程中，分别在CIgM-HC2的羧基端、CIgM-HC3的氨基端加一个半胱氨酸(Cys)；在多肽不同位置中加入半胱氨酸是在不影响多肽结构的情况下提供KLH的偶联位点；

以多肽偶联试剂盒对3条多肽分别与载体蛋白KLH偶联；

2)杂交瘤细胞株的获得：

偶联KLH的3条多肽分别免疫Balb/C小鼠，背部皮下注射，150μg/只；每隔15天检测抗体效价；每组选择草鱼IgM抗体效价高的小鼠，取脾脏细胞，与适量的小鼠骨髓瘤细胞进行融合，每只小鼠融合10块96孔板进行克隆筛选实验；

分别用纯化的草鱼IgM包被ELISA板，对融合的细胞上清进行ELISA筛选，挑选阳性克隆扩大到24孔细胞培养内进行培养，每个克隆进行3轮亚克隆，以确保细胞株分泌抗体的稳定性；最终选择1株杂交瘤细胞株CIgM-2E7作为优选细胞；对优选的杂交瘤细胞株CIgM-2E7扩大培养、验证，交由中国典型培养物保藏中心收藏，保藏号为：C2017130。

2.一种草鱼IgM单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：

培养步骤：培养保藏号为C2017130的杂交瘤细胞株，使之分泌单克隆抗体；

纯化步骤：将单克隆抗体纯化。

3.一种草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，将权利要求1所述的草鱼IgM单克隆抗体应用于检测鱼类Ig水平的试剂或试剂盒的制备。

4.如权利要求3所述的草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒以草鱼IgM单克隆抗体作为固相包被物，以HRP标记的病毒蛋白作为检测抗原。

5.一种草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，将权利要求1所述的草鱼IgM单克隆抗体应用于治疗鱼类病毒感染的药物的制备。

6.一种草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，将权利要求1所述的草鱼IgM单克隆抗体应用于评价鱼类疫苗免疫效果的试剂的制备。

7.一种草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，权利要求1所述的草鱼IgM单克隆抗体在鱼类免疫功能评价方面的应用。

8.如权利要求7所述的草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，所述免疫功能评价为草鱼对草鱼呼肠孤病毒II型的免疫功能评价或大口黑鲈对大口黑鲈病毒的免疫功能评价。

9.如权利要求7所述的草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，鱼类免疫功能评价包括：

包被步骤：用包被液将草鱼IgM单克隆抗体稀释至浓度为1-3μg/mL，包被聚苯乙烯反应板；包被液为浓度0.05mol/L、pH为9.6的碳酸盐缓冲液；

封闭步骤：在反应板的反应孔中加入无蛋白封闭液；

样本加入步骤：反应孔中加入稀释的血清样本，再加入洗涤液进行洗涤，拍干；洗涤液为pH为7.4、含0.05vt％Tween-20的PBS溶液；

检测抗原加入步骤：稀释HRP标记的病毒蛋白后加入反应孔，用洗涤液洗涤，拍干；

显色步骤：加入TMB显色液进行避光显色；

终止步骤：加入终止液，读取OD_450nm值；终止液为2mol/L的H₂SO₄溶液。

10.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，该杂交瘤细胞株产生草鱼IgM单克隆抗体，其保藏号为C2017130。