[发明专利]苗期草莓炭疽病潜伏侵染及其用药的快速检测法

说明书

本发明公开了一种苗期草莓炭疽病的环介导等温扩增检测方法以及所用的环介导等温扩增引物；采用该方法能用于进行现场快速检测草莓种苗是否带菌。本发明还公开了一种检测抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP检测方法及所用的LAMP引物；采用该方法能特异性检测出对QoI类杀菌剂高抗的草莓胶孢炭疽菌。本发明具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对草莓炭疽病的苗期检测、抗药性流行预警具有重要的现实意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及检测苗期草莓植株带菌及草莓胶孢炭疽菌抗QoI类杀菌剂的环介导等温扩增(LAMP)引物组及其使用方法，属于植物病害检测、鉴定、防治及抗药性早期预警的技术领域。

背景技术

草莓(Fragaria ananassa)，蔷薇科，草莓属，是宿根性多年生常绿草本植物，在园艺学上属于浆果类水果。在世界各种浆果中，草莓的栽培面积和产量仅次于葡萄，居第二位。由于草莓收益高，见效快，而且含有丰富的蛋白质和维生素，受到生产者和消费者的喜爱。近年来，中国草莓种植面积迅速增长，2015年，中国成为最大的草莓生产国，总种植面积13万hm²，年产量达350万t(农业部2017年数据)。随着草莓消费量的快速上升，促进了草莓栽培产业的迅速发展，种植面积逐渐增加。然而由于产区相对固定，连作危害暴露，病害种类逐年增多，危害程度持续加重，导致经济效益下降。

草莓炭疽病已经成为了草莓的主要病害，并且在许多国家均有发生。我国草莓炭疽病主要分布在温暖的南方地区，浙江和上海发生较重。炭疽病可以发生在草莓生产上的整个生产周期中，特别是苗期和移栽阶段。胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)可导致草莓植株各个部位发生病变，而以短缩茎、匍匐茎、叶柄最易受害，湿度高时病部可见粉红色分生孢子堆，在发生严重情况下导致植物坍塌和死亡。草莓炭疽病菌具有典型潜伏侵染的特点，草莓可通过匍匐繁殖，一旦种苗带菌，到了适宜的条件，植株发病造成大量损失。草莓炭疽病主要发生在育苗期，该病发生适温28-32℃，属于高温型病害。筛选无菌种苗是防控草莓炭疽病是最经济有效的途径。在大部分地区，除种植一些无菌和高抗品种外，种植者都要依靠一些化学防治手段进行病害防控，但随着炭疽菌抗药性的不断增强，杀菌剂防治炭疽菌的效果都不太理想。

甲氧基丙烯酸酯(QoI)类杀菌剂是一类来源于具有杀菌活性的天然抗生素strobilurinA的杀菌剂，包括嘧菌酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯等，具有广谱高效的抗菌活性。由于其具有独特的作用靶标，与其它现有杀菌剂不存在交互抗性。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂作用于真菌线粒体呼吸链上的复合体III，通过与cytb基因编码的cytb的Qo位点结合来抑制呼吸链上的电子传递，进而影响呼吸作用阻碍病原真菌的合成，干扰细胞正常分裂和生长，进而造成菌体死亡。在甲氧基丙烯酸酯杀菌剂开发和使用早期，对其抗药性风险的研究认为这类药剂为中等抗药性风险。实际上在这类杀菌剂应用两年后就产生了抗药性，且防治效果下降。现已归为高抗药性风险。有报道称甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂醚菌酯对葡萄炭疽病的防效不理想，也有检测到对嘧菌酯高抗的瓜类炭疽菌的报道。植物病原菌对QoIs类杀菌剂产生抗药性的机理主要是病原菌cytb基因DNA序列上的G143A、F129L和G137R氨基酸残基发生单点突变或旁路氧化途径被启动。草莓炭疽病田间抗药性的产生的主要原因是点突变G143A，含有点突变G143A的菌株表现为高抗，而且该点突变引起的抗性水平稳定。