[发明专利]能检测多种猪猝死症病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒

说明书

本发明涉及生物检测技术，旨在提供一种能检测多种猪猝死症病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒。该试剂盒包括：反转录和预扩增引物混合液、探针混合液、MLPA缓冲液、连接缓冲液A、连接缓冲液B、连接酶Ligase‑65、PCR反应混合液、SALSA聚合酶、阴性对照、阳性对照。与现有技术相比，本发明具有高通量、特异性好和灵敏度高的特点。能同时检测6种引起猪猝死的病原，利用全自动核酸分析仪每次可同时检测96个样品。通过探针设计、序列比对和blast分析，确保探针只与目标基因相结合。进行检测时只从对应模板中扩增出相应大小的目的片段，对其他病原并无扩增。通过增加RT‑PCR这一步骤对目标基因进行富集，最低可检出1拷贝的目标基因。

技术领域

本发明提供了一种用于检测猪繁殖与呼吸道综合症病毒、猪瘟病毒、尼帕病毒、非洲猪瘟病毒、产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的多重连接探针扩增鉴别检测试剂盒及引物和探针，可实现同时检测6种引起猪猝死的病原，属于检验检疫领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、尼帕病毒(NiPV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)是引起猪猝死症的常见病原。虽然我国尚没有发现非洲猪瘟和猪尼帕病，但是我国周边国家和亚洲地区已有疾病发生的报道，也应该加以重视，做好技术储备和监测预警，防患于未然。

由于引起猪猝死症的疾病不止一种，在临床诊断方面，不同菌(毒)株毒力不同，且存在与其它病原的混合感染，使得通过临床症状和病理变化很难对致病原因进行确诊。此外，由于该病发病迅速，需短时间内确定致病原因并进行预防和治疗。虽然对引发猪猝死的因素都有相应的方法和策略，但尚没有一种方法可以一次性对引起猪猝死的多种疾病进行鉴别。因此建立一种能精准、快速、高效区分不同病原的检测方法，对于猪猝死症的预防和发生至关重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种能检测多种猪猝死症病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒，以及利用该试剂盒同时检测多种猪猝死症病原的多重连接探针扩增检测方法。

为解决技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种能检测多种猪猝死症病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒，该试剂盒包括：

(1)反转录和预扩增引物混合液；该混合液中包括序列SEQ ID NO：1～9所示的用于猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪瘟病毒、尼帕病毒的反转录引物和非洲猪瘟病毒、产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的预扩增引物；

(2)探针混合液；该混合液中包括序列SEQ ID NO：10～21所示的用于检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪瘟病毒、尼帕病毒、非洲猪瘟病毒、产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的左侧和右侧探针；

(3)MLPA缓冲液；

(4)连接缓冲液A；

(5)连接缓冲液B；

(6)连接酶Ligase-65；

(7)PCR反应混合液，该混合液中包括序列SEQ ID NO:22和23所示通用引物；

(8)SALSA聚合酶；

(9)阴性对照；

(10)阳性对照。