[发明专利]能检测多种猪猝死症病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒

权利要求书

1.一种能检测多种猪猝死症病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

（1）反转录和预扩增引物混合液；该混合液中包括序列SEQ ID NO：1～9所示的用于猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪瘟病毒、尼帕病毒的反转录引物和非洲猪瘟病毒、产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的预扩增引物；

（2）探针混合液；该混合液中包括序列SEQ ID NO：10～21所示的用于检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪瘟病毒、尼帕病毒、非洲猪瘟病毒、产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的左侧和右侧探针；

（3）MLPA缓冲液；

（4）连接缓冲液A；

（5）连接缓冲液B；

（6）连接酶Ligase-65；

（7）PCR反应混合液，该混合液中包括序列SEQ ID NO:22和23所示通用引物；

（8）SALSA聚合酶；

（9）阴性对照；

（10）阳性对照；

所述序列SEQ ID NO：1是猪繁殖与呼吸道综合征病毒反转录引物；序列SEQ ID NO：2是猪瘟病毒反转录引物；序列SEQ ID NO：3是尼帕病毒反转录引物；序列SEQ ID NO：4和SEQID NO：5分别是非洲猪瘟病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7分别是产气荚膜梭菌预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9分别是猪胸膜肺炎放线杆菌预扩增的正向和反向引物；序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11分别为检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13分别为检测猪瘟病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15分别为检测尼帕病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQ ID NO：16和SEQ ID NO ：17分别为检测非洲猪瘟病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19分别为检测产气荚膜梭菌的左侧探针和右侧探针；序列SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21分别为检测猪胸膜肺炎放线杆菌的左侧探针和右侧探针；序列SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23分别是通用正向和反向引物；其中，序列SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21的5’端进行磷酸化处理；

所述阳性对照是基因体外转录RNA与阳性重组质粒DNA的混合物；其中基因体外转录RNA是指猪繁殖与呼吸道综合征病毒的M基因、猪瘟病毒的E2基因和尼帕病毒的N基因体外转录RNA，阳性重组质粒DNA是指非洲猪瘟病毒的p27基因、产气荚膜梭菌的plc基因和猪胸膜肺炎放线杆菌的ApxIVA基因的阳性重组质粒DNA。

2.利用权利要求1所述试剂盒同时检测多种猪猝死症病原的多重连接探针扩增检测方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于，其操作流程如下：

（1）磁珠法提取样品DNA/RNA；

用TIANGEN公司的磁珠DNA/RNA共提取试剂盒，使用天隆NP968全自动核酸提取仪同时提取样品中的DNA和RNA，得到200 µL样品；

（2）RNA反转录成cDNA及预扩增

按照QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Kit说明书进行一步法反转录RT-PCR反应；配制25 μL反应体系：10 μL OneStep Ahead RT-PCR Master Mix，1 μL OneStep Ahead RT-Mix，5 μL DNA或RNA，5 μL反转录和预扩增引物混合液，终浓度为每条引物0.5 μM；4 μLH₂O补足；反应条件：50℃ 10 min，95℃ 5 min；95℃ 15 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，40个循环；72℃ 2 min；

（3）MLPA检测

a、DNA变性

取0.2 mL PCR反应管，每管加入0.5 μL DNA溶液和4.5 μL TE，98℃变性5 min，降至室温25℃；

b、探针与样本DNA的杂交

配制3 μL混匀的探针混合液：1.5 μL MLPA缓冲液 + 1.5 μL探针混合液；将探针混合物加入上述PCR管中，95℃温育1 min，60℃杂交1-16 h，54℃温育；

c、杂交探针的连接

配制32 μL连接酶混合物：25 μL dH₂O + 3 μL 连接缓冲液A + 3 μL 连接缓冲液B + 1μL连接酶Ligase-65；PCR仪温度降至54℃，打开管盖，加入32 μL连接酶混合物，54℃温育15min，98℃加热5 min灭活连接酶，20℃温育；

d、连接探针的PCR扩增

配制10 μL PCR混合液：7.5 μL dH₂O + 2 μL PCR反应混合液 + 0.5 μL SALSA聚合酶；取出PCR管，室温下加入10 μL PCR混合物；开始PCR反应，反应条件为：95℃ 30 s，60℃ 30s，72℃ 60 s，35个循环；72℃孵育20 min，降至15℃；

e、全自动核酸分析仪分析：

PCR扩增产物用全自动核酸分析仪进行分析；

（4）结果描述及判定

a、质控标准：

阳性对照在94 bp、106 bp、116 bp、126 bp、135 bp、144 bp处有特异性扩增条带；

阴性对照无特异性扩增条带；

如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效；

b、结果判断：

阳性：在94 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪繁殖与呼吸道综合征病毒；在106 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪瘟病毒；在116 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在尼帕病毒；在126 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在非洲猪瘟病毒；在135 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在产气荚膜梭菌；在144 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪胸膜肺炎放线杆菌；可对MLPA扩增产物进行测序，进一步确认；

阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪瘟病毒、尼帕病毒、非洲猪瘟病毒、产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌。