[发明专利]一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌菌株和制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌菌株和制备方法及其应用，本发明通过基因工程的方法通过在地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中插入ilvB基因，得到地衣芽孢杆菌DW2‑ilvB，相对于地衣芽胞杆菌DW2来说，该菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了11%以上。

技术领域

本发明涉及一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌菌株和制备方法及其应用。

背景技术

杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，杆菌肽的组成氨基酸包括鸟氨酸（Orn），D-苯丙氨酸（D-Phe），异亮组氨酸（His）, D-天冬氨酸（D-Asp）, 天冬酰胺（Asn）、 赖氨酸（Lys）, D-谷氨酸（D-Glu），半胱氨酸（Cys），亮氨酸（Leu），异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）11种氨基酸。杆菌肽为一种广谱抗菌素，其主要通过抑制细胞壁的合成来抑制细菌的生长。杆菌肽能够有效抑制革兰氏阳性菌，如梭状芽孢杆菌属、葡萄球菌属，链球菌属、棒状杆菌属和奈瑟球菌属等，对部分革兰氏阴性菌如脑膜炎双球菌、流感杆菌、放线菌也有较好的抑制作用。杆菌肽几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。

杆菌肽主要是由枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌通过非核糖体合成酶进行合成的。目前，鉴于组成杆菌肽的这12种氨基酸在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌内的含量并不清楚，哪种或哪几种氨基酸是限制杆菌肽高产的关键氨基酸也尚不清楚，再加上，细胞内的氨基酸具有严格、且复杂的调控机制，因此，想要通过调节氨基酸调控来提高杆菌肽产量并非易事。

乙酰羟酸合成酶是异亮氨酸合成途径的一个关键酶，其合成基因为IlvB基因。虽然，异亮氨酸虽然是组成杆菌肽的12种氨基酸之一，但是，其合成途径的强弱与杆菌肽产量之间的关系并无报道。异亮氨酸合成途径的关键酶有很多，乙酰羟酸合成酶也只是这些关键酶中的其中一个，因此，乙酰羟酸合成酶对异亮氨酸的影响并不清楚。并且，异亮氨酸的合成是受多方面因素调控的，单纯的对异亮氨酸的合成途径的其中一个关键酶进行强化，能否提高异亮氨酸的产量不可预知。另外，杆菌肽的合成也是受多方面因素调控和影响的，单纯提高异亮氨酸的含量是否能够杆菌肽的产量也不可预知。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法，此构建方法通过在地衣芽孢杆菌的基因组内插入ilvB基因，达到了提高杆菌肽产量的目的。

一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的构建方法，包括以下步骤：

（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ilvB基因片段；

（2）在ilvB基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的ilvB表达元件；

（3）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ilvB基因的上游同源臂和ilvB基因的下游同源臂；

（4）通过重叠延伸PCR将ilvB基因的上游同源臂、ilvB表达元件和ilvB基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：ilvB基因的上游同源臂-ilvB表达元件-ilvB基因的下游同源臂；

（5）采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；