[发明专利]一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌菌株和制备方法及其应用

权利要求书

1.一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的构建方法，包括以下步骤：

（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ilvB基因片段；

（2）在ilvB基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的ilvB表达元件；

（3）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ilvB基因的上游同源臂和ilvB基因的下游同源臂；

（4）通过重叠延伸PCR将ilvB基因的上游同源臂、ilvB表达元件和ilvB基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：ilvB基因的上游同源臂-ilvB表达元件-ilvB基因的下游同源臂；

（5）采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

（6）准备质粒 T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

（7）将步骤（5）得到的酶切基因片段和步骤（6）得到的线性质粒片段经 DNA连接酶进行连接，得到整合质粒T2(2)-ilvB；

（8）将整合质粒T2(2)-ilvB转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

（9）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ilvB基因的上游同源臂或ilvB基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（10）挑选ilvB基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株和ilvB基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到整合了ilvB基因的地衣芽孢杆菌DW2-ilvB；

其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；

所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的ilvB基因为SEQ ID NO.1中所示。

2.根据权利要求1所述的一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB。

3.根据权利要求2所述的一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB，其保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2017555，保藏日期为2017年9 月27日。

4.根据权利要求2所述的一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB在抗菌肽生产中的应用，其特征在于，该应用步骤包括： A种子发酵，B生产发酵。

5.根据权利要求4所述的一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB在抗菌肽生产中的应用，其特征在于，所述种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2。

6.根据权利要求4所述的一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB在抗菌肽生产中的应用，其特征在于，所述生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO₃和0.5-2 g/L (NH₄)₂SO₄。