[发明专利]一种细胞核的提取方法

说明书

本发明属生物医学技术领域，涉及一种细胞核提取的方法，尤其是从离体的犬心室肌和分离的犬心室心肌细胞中分离细胞溶质、膜和核级分的方法，本发明的方法包括步骤：步骤一、获得离体的犬心肌细胞，步骤二、亚细胞分馏。本方法有助于获取到大量可用于基础研究及临床应用的人功能性细胞核；能安全有效地实现对特定类型人类细胞的筛选和富集，使所获细胞具备更好的生物安全性；本发明全面地检测了所分离细胞核的生物学特征和功能，为所述细胞核分离的研究和应用提供了可靠的数据，为其他新型细胞的细胞核提取评估提供了一套可供参考的方法体系。

技术领域

本发明属生物医学技术领域，涉及细胞核提取的方法，具体涉及一种从离体的实验动物心脏心肌和心室肌细胞样本中分离和提取细胞核的方法。

背景技术

现有技术公开了核膜中包含基因组并且负责DNA的复制和转录以及新生RNA成熟的分子机制。有研究表明，将越来越多的功能归功于核膜，包括通过受体及其作用剂、离子通道以及位于核膜本身内的离子泵和转运体分隔DNA。本领域知晓，尽管细胞核在结构和功能上很重要，但是由于与体内可及性相关的挑战，从心脏细胞中完整分离细胞核并完全纯化以允许体外研究等方面的相关知识仍然很少。

研究显示，与大多数哺乳动物细胞相反，由于胎儿生长过程中的核结核，心肌细胞中存在非病理多核化，核被封闭在双重脂质双层中，提供通过核孔复合物选择性地进入细胞质的细胞核核膜，也可以提供额外的内分泌信号过程的平台对基因表达水平进行控制。核膜本身包括外核膜和内核膜，其由40-50nm的核周空间分开，核与细胞间隙被核孔复合体所覆盖，内核膜的内表面衬有由核纤层蛋白形成的核中间遗传结构网络，外核膜与外周内质网相连并含有许多与外周内质网共同的蛋白质，相比之下，内核膜含有具有细胞核特异的许多不同的整合膜蛋白，与染色质具有直接相互作用。最近的研究实验证据表明，包括阿片样物质、肾上腺素能、内皮素和血管紧张素受体的许多G蛋白偶联受体定位于核膜并调节基因表达。然而，局限于心脏核膜受体的分子药理学和生理学功能仍然很少被发掘，这很大程度上归因于与所述的受体在体内可及性相关的挑战以及分离后是否存活，纯度高的完整核从心脏细胞到体外的研究。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种细胞核提取的方法，具体涉及一种从离体的实验动物心脏心肌和心室肌细胞样本中分离和提取细胞核的方法。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一种细胞核提取的方法，具体涉及一种从离体的实验动物心脏心肌和心室肌细胞样本中分离和提取细胞核的方法。

本发明提出了从从离体的实验动物心肌组织和分离的成年心室心肌细胞中分离完整核的技术方案，本发明方法基于质膜对于黄体素和破碎细胞的部分通透性，以及差异和不连续的蔗糖密度离心，提供了非核膜等细胞溶质与细胞核的快速分离的方法。

本方法中，公开了从离体的实验动物犬心室肌和分离的犬心室心肌细胞中分离细胞溶质，膜和核级分的方法(如表1所示)；由于核膜不含胆固醇，其完整性不受黄芪素治疗的影响，为了分离完整且具有酶活性的核，本方法选择性地采用渗透质膜分离与甾醇相互作用的强心苷和洋地黄苷，透化后，使用Dounce匀浆器，然后通过差示蔗糖密度梯度离心(如图1所示)，通过机械粉粹从剩余的细胞器体中释放细胞核，所得的核富集部分适用于有关功能研究。

表1：心脏亚细胞器的大小和密度

具体而言，本发明的一种细胞核的提取方法，其包括步骤：

步骤一、获得离体的犬心肌细胞，

步骤二、亚细胞分馏。

本发明的步骤一中包括分步骤：

1.准备含氧化合物缓冲液及有关器械和灌注装置；

2.常规处理实验动物获得离体实验动物心脏；