[发明专利]一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法

权利要求书

1.一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、精液处理

1)收集新鲜精液，并将精液放置于37℃培养箱中液化30min；

2)用1ml的移液枪吸取1ml精子密度梯度分离液的lower液，再用1ml的移液枪吸取1ml精子密度梯度分离液中的upper液，贴壁加到精子密度梯度分离液的lower液上方,将液化完全的新鲜精液加入精子密度梯度分离液upper液的上方，采用非连续密度梯度离心法离心，300g离心20min，离心结束后弃去上清液,保留沉淀；

3)用1ml的移液枪吸取4ml含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液加入第2)步得到的沉淀里，用移液枪吹打混匀，采用非连续密度梯度离心法进行离心，500g离心5min，离心结束后弃去上清液，保留沉淀；

4)用1ml的移液枪吸取0.3ml含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液贴壁加入第3)步中得到的沉淀上方，并放置于37℃、二氧化碳浓度设定为5.5％的培养箱中上游30min，然后用1ml的移液枪吸出250μl的上清液放入5ml小试管中；

B、精液浓缩

1)首先用10μl的移液枪吸取5μl步骤A第4)步中的精液于精子计数板上进行计数，统计精子的密度ρ，统计后得出的精子的密度ρ低于40×10⁶个/ml，则需要对精液样本进行浓缩，精液浓缩具体步骤如下；

2)用100μl的移液枪吸取50μl步骤A第4)步中上游完成的精液放入0.5ml离心管中，采用混合离心法进行离心，500g离心5min，离心结束后弃去上清液；

3)向步骤B第2)步得到的沉淀中加入10～25μl的含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液，授精输卵管培养液的添加量V根据精子的密度ρ计算，具体计算方法如下：

V＝ρ×50μl/(40x10⁶个/ml)；

C、精子活力的测定

1)用10μl的移液枪吸取5μl步骤B中浓缩后的精液于精子计数板上进行计数，统计前向运动精子的比例；

2)分别用10μl的移液枪吸取2.5μl步骤A第4)步中的精液和7.5μlPVP 7％solution放置于0.5ml离心管中，充分吹打，将混合溶液充分混匀并放置于37℃、二氧化碳浓度为5.5％的培养箱中静置10min；

3)用10μl的移液枪吸取5μl步骤2)中的精液于精子计数板上进行计数，统计前向运动精子的比例；

4)将步骤1)中统计出的前向运动精子的比例与步骤3)中统计出的前向运动精子的比例进行对比即可；

D、预测弱畸精子症的体外受精能力

1)根据步骤A中第1)～第4)步的操作和步骤C中第1)步的操作，分别检测正常精子组和弱畸精子组前向运动精子的比例，将前向运动精子的比例小于90％的实验对象剔除；

2)根据步骤C中第2)、3)步的操作，分别检测正常精子组和弱畸精子组中加入PVP 7％solution后前向运动精子的比例，正常精子组定义为T1组，弱畸精子组中加入PVP 7％solution后前向运动精子的比例大于或等于50％的定义为T2组，弱畸精子组中加入PVP7％solution后前向运动精子的比例小于50％的定义为T3组；结果显示，向弱畸精子中加入PVP 7％solution后，前向运动精子的比例小于50％的对象体外受精率极低，因此，可以通过向弱畸精子中加入PVP 7％solution来预测弱畸精子症的体外受精能力。

2.根据权利要求1所述的一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，其特征在于：所述非连续密度梯度离心机的型号为Eppendorf 5702，所述混合离心机的型号为eppendorfminispin plus，所述非连续密度梯度离心机和所述混合离心机均采购自德国的艾本德公司。

3.根据权利要求1所述的一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，其特征在于：所述含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液型号为Quinn’s 1020，采购自美国的SAGE药厂。

4.根据权利要求1所述的一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，其特征在于：所述培养箱型号为SANYO MCO-5AC，采购自日本的三洋二氧化碳培养箱。