[发明专利]一种用于校正扩增子测序中扩增偏差的方法

说明书

本发明公开了一种校正扩增子测序中扩增偏差的方法，通过扩增靶核酸，获取靶核酸的扩增子覆盖度，计算每个测试基因组区域靶核酸和参考基因组区域靶核酸之间的扩增子覆盖度比值，去除异常值，应用公式对扩增子覆盖度比值进行归一化，计算测试基因组区域扩增子和参考基因组区域扩增子之间各项参数的差值和应用另一公式拟合数据等步骤，将通过拟合计算得出的回归参数值用于校正扩增偏差，得到去除扩增偏差后的归一化扩增子覆盖度比值，从而消除了多重PCR扩增过程中因实验因素引起的扩增偏差。扩增偏差的消除有利于目标基因组区域拷贝数的精确计算，从而使应用扩增子测序数据检测微小拷贝数的变异成为可能。

技术领域

本发明涉及的是用于校正扩增子测序中扩增偏差的计算方法。

背景技术

下一代测序或大规模平行测序通常使用的是多重聚合酶链式反应(PCR)产生的文库。3′端稳定性、引物解链温度(Tm)、扩增子长度、扩增子GC含量和扩增子侧翼区GC含量的差异都可能会导致扩增偏差。这种偏差干扰了对目标基因组区域拷贝数的精确计算，并阻碍了扩增子测序在检测微小拷贝数变异中的应用。

通过细致优化引物设计、退火温度、缓冲液组成和PCR循环次数等因素，可以最大限度地减少偏差。见Markoulatos等(2002年)的《临床实验室分析杂志》，16:47-51。另外也可以通过消除扩增偏差的计算方法来校正原始数据。不过仍然需要采用更好的方法来校正用于扩增子测序多重扩增产生的固有偏差。

提供本背景信息的目的是阐明申请人认为已知的信息与本发明可能有关，不必认为也不应解释为上述任何信息是依照本发明推衍的现有技术。

发明内容

本发明旨在探索一种新的扩增偏差校正方法。采用一种计算方法消除多重PCR扩增过程中由于3′端稳定性、引物解链温度(Tm)、扩增子长度、扩增子GC含量、扩增子侧翼区GC含量差异等因素引起的扩增偏差。

一方面，本发明涉及了扩增偏差的校正方法，其步骤为：

a)扩增靶核酸；

b)获取靶核酸扩增子覆盖数据；

c)计算各靶核酸测试基因组区域和参考基因组区域之间的扩增子覆盖度比值；

d)去除异常值；

e)根据公式归一化各靶核酸测试基因组区域和参考基因组区域之间的扩增子覆盖度比值，公式为：

f)计算测试基因组区域扩增子和参考基因组区域扩增子之间各项参数的差值，包括引物3′端稳定性(Diff_{3′端稳定性})、引物解链温度(Diff_Tm)、扩增子长度(Diff_{扩增子长度})、扩增子GC含量(Diff_扩增子GC)和扩增子侧翼区GC含量(Diff_{扩增子侧翼GC})；

g)根据公式拟合数据，得到回归参数值A₁、A₂、A₃、A₄和A₅，公式为：log(归一化覆盖度比值)＝

A₁×Diff_{3′端稳定性}+A₂×Diff_Tm+A₃×Diff_{扩增子长度}+A₄×Diff_扩增子GC+A₅×Diff_{扩增子侧翼GC}；

h)使用回归参数值A1、A2、A3、A4和A5校正扩增偏差，得到去除扩增偏差后的归一化扩增子覆盖度比值。