[发明专利]核酸的化学连接方法

说明书

本文提供了用于使用本文描述的各种化学连接和点击化学反应来制备核酸文库、捕获从有限数目的细胞中获得的DNA、以及选择性裂解ssDNA或dsDNA的方法。

领域

本申请大体上涉及使用化学连接制备核酸文库和捕获核酸。

背景

单细胞应用和无细胞DNA应用的低DNA输入对于用于DNA测序的文库制备的转化效率提出了高的要求。转化效率很大程度上由测序衔接子与感兴趣的DNA文库的酶促连接效率决定。由于低的酶促连接效率，核酸的酶促连接通常具有低的转化率。

包括使用各种化学品诸如溴化氰的多种化学连接方法是已知的。此外，已经描述了涉及硫代磷酸酯和碘乙酰基、溴乙酰基、甲苯磺酸酯(tosylate)和碘修饰的核苷的亲核反应。最近，使用基于1,3-偶极环加成的方法的点击化学已经在各种背景中使用。

生物相容的连接方法是已知的，其包括在5’碘和3’硫代磷酸酯之间形成硫代磷酸酯连接的连接反应，以及包括在3’叠氮化物和5’炔之间形成三唑基接头的反应的点击连接。3’炔基和5’叠氮基连接或3’叠氮基和5’炔基基团可以用于点击连接。前者已经被证明具有完全的生物相容性，因为它在聚合酶链式反应中被聚合酶忠实地拷贝。后者也可以被聚合酶拷贝，但导致1个跳过的碱基。具有3’叠氮基修饰的碱基不被聚合酶读取。

目前，来自小样品容量的核酸的测序和核酸文库的创建受低酶促连接效率的影响，导致所得测序结果中的空位。此外，从小样品中捕获核酸本身可能受与酶促连接相关的低效率影响。

因此，本领域对于将核酸连接在一起以提高测序输出和准确度的高效方法存在需求。本发明满足了该需求并且还提供了相关的优点。

简要概述

本文特别地提供了对于从样品中制备核酸文库和捕获核酸有用的方法。本文描述的方法可以提高从给定的样品中制备核酸文库的效率，该给定的样品包括例如在样品中含有非常少量的核酸的样品。例如，使用本文描述的化学连接方法可以提高由于使用标准技术的低酶促连接效率而导致的低转化率。

在一个方面是从样品制备核酸文库的方法，该方法包括：

(i)使包含多于一个细胞核酸的样品与多于一个衔接子核酸反应，所述多于一个细胞核酸各自具有末端3’-修饰的双脱氧核苷酸(ddNTP)，该末端3’-修饰的双脱氧核苷酸(ddNTP)包含能够参与点击化学反应的3’-功能部分，所述多于一个衔接子核酸各自包含末端5’-修饰的ddNTP，该末端5’-修饰的ddNTP包含能够与3’功能部分参与点击化学反应的相容的5’-功能部分，其中所述3’功能部分和所述5’功能部分反应以形成修饰的骨架连接，从而形成多于一个连接的核酸；以及

(ii)扩增所述多于一个连接的核酸，从而从样品中制备核酸文库。

在一个方面是从样品中制备核酸文库的方法，该方法包括：

(i)使包含多于一个细胞核酸的样品与多于一个衔接子核酸反应，所述多于一个细胞核酸各自具有末端3’-修饰的ddNTP，该末端3’-修饰的ddNTP包含能够参与点击化学反应的3’-功能部分，其中通过使多于一个细胞核酸与非模板依赖性聚合酶接触，3’-修饰的ddNTP被掺入到多于一个细胞核酸的每一个中，所述多于一个衔接子核酸各自包含末端5’-修饰的ddNTP，该末端5’-修饰的ddNTP包含能够与3’功能部分参与点击化学反应的相容的5’-功能部分，其中所述3’功能部分和所述5’功能部分反应以形成修饰的骨架连接，从而形成多于一个连接的核酸；以及

(ii)扩增所述多于一个连接的核酸，从而从样品中制备核酸文库。

在另一个方面是从样品中制备核酸文库的方法，该方法包括：