[发明专利]核酸的化学连接方法

权利要求书

1.一种从样品中制备核酸文库的方法，所述方法包括：

(i)使包含多于一个细胞核酸的样品与多于一个衔接子核酸反应，所述多于一个细胞核酸各自具有包含能够参与点击化学反应的3’-功能部分的末端3’-修饰的双脱氧核苷酸(ddNTP)，所述多于一个衔接子核酸各自包含末端5’-修饰的ddNTP，所述末端5’-修饰的ddNTP包含能够与所述3’功能部分参与点击化学反应的相容的5’-功能部分，其中所述3’功能部分和所述5’功能部分反应以形成修饰的骨架连接，从而形成多于一个连接的核酸；以及

(ii)扩增所述多于一个连接的核酸，从而从所述样品中制备核酸文库。

2.如权利要求1所述的方法，其中通过使所述多于一个细胞核酸与非模板依赖性聚合酶接触，所述末端3’-修饰的ddNTP被掺入到所述多于一个细胞核酸的每一个中。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述非模板依赖性聚合酶是RNA-特异性核苷酸转移酶。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述非模板依赖性聚合酶是DNA-特异性核苷酸转移酶。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述非模板依赖性聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、多聚A聚合酶或CCA-添加RNA聚合酶。

6.如权利要求2所述的方法，其中所述非模板依赖性聚合酶是TdT。

7.如权利要求6所述的方法，其中TdT以至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的收率掺入所述末端3’-修饰的ddNTP。

8.如权利要求6所述的方法，其中TdT以约0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、7μM、10μM或更多的量存在。

9.如权利要求2-8中任一项所述的方法，其中所述末端3’-修饰的ddNTP由所述非模板依赖性聚合酶在约20℃至约40℃的温度进行的反应中掺入。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述末端3’-修饰的ddNTP由所述非模板依赖性聚合酶在持续在约15min、20min、30min、60min、90min、120min或更长时间内进行的反应中掺入。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述3’功能部分选自由以下组成的组：叠氮化物、炔基、烯基、硫醇或硝酮。

12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述3’功能部分包括叠氮化物或炔基。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述5’功能部分与所述3’功能部分不同并且与所述3’功能部分相容，并且选自由以下组成的组：叠氮化物、炔基、烯基、硫醇或硝酮。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中3’功能部分和5’功能部分选自以下对：

(i)3’-叠氮基/5’-炔基；

(ii)3’-炔基/5’叠氮基；

(iii)3’-硫醇/5’-炔基；

(iv)3’-硫醇/5’-烯基；

(v)3’-炔基/5’-硫醇；

(vi)3’-烯基/5’-硫醇；

(vii)3’-叠氮基/5’-环辛炔基；

(viii)3’-环辛炔/5’-叠氮基；

(ix)3’-硝酮/5’-环辛炔基；或

(x)3’-环辛炔基/5’-硝酮。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述3’功能部分包含3’-叠氮基，并且所述5’功能部分包含5’-炔基。