[发明专利]用于分析无细胞DNA的核酸样品制备方法

说明书

本文公开的技术方面涉及制备和分析核酸(例如cfDNA)的方法。在一些实施方案中，本文提供了制备用于序列分析(例如，使用下一代测序)的核酸的方法。

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请No.62/395,347的优先权，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本文描述的技术涉及可用于制备用于分析的核酸分子的方法和组合物。

背景技术

在下一代测序之前的靶标富集比全基因组、全外显子组和整个转录组测序更具成本效益，因此对于用于研究发现和临床应用的广泛实施更加实用。例如，由靶标富集方法提供的高覆盖深度使等位基因计数(在基因表达和拷贝数评估中)和低频突变的检测能够具有更宽的动态范围，这有利于评估癌症中的体细胞突变。用于下一代测序的当前富集方案的实例包括基于杂交的捕获测定(TruSeq Capture，Illumina；SureSelect HybridCapture，Agilent)和基于聚合酶链式反应(PCR)的测定(HaloPlex，Agilent；AmpliSeq，IonTorrent；TruSeq Amplicon，Illumina；emulsion/digital PCR，Raindance)。基于杂交的方法不仅捕获由捕获探针覆盖的靶序列，而且捕获消耗测序能力的脱靶基因附近。另外，这些方法相对耗时、劳动强度大，并且具有相对低的特异性水平。

发明简述

本文公开的技术的方面涉及制备和分析核酸的方法。在一些实施方案中，本文提供的方法可用于检测核酸制备物(包括无细胞DNA制备物(例如，来自尿液或血液样品))中的超低等位基因频率变体(例如，融合、单核苷酸变体、拷贝数变体)。在一些实施方案中，本文提供的方法涉及基于连接的捕获，其富集高度片段化的材料，使得该方法特别可用于检测无细胞DNA制备物中的变体。在一些实施方案中，本文提供的方法有助于从片段化输入(包括例如从无细胞DNA制备物)产生高覆盖(例如，高独特覆盖)测序文库。在一些实施方案中，独特的分子深度相对于从个体(例如携带肿瘤的个体)提取的核酸的常规方法得到极大改善。在一些实施方案中，与从个体(例如携带肿瘤的个体)提取的核酸的常规方法相比，覆盖深度至少加倍。在一些实施方案中，由于改善的前端捕获化学，实现了改善的深度。在一些实施方案中，本文提供的方法可用于通过测序评估RNA免疫文库。在一些实施方案中，本文提供了可用于制备用于序列分析(例如，使用下一代测序)的核酸样品的方法和组合物。在一些实施方案中，本文描述的技术涉及确定核酸序列的方法。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物涉及在测序之前富集包含一种或更多种靶核苷酸序列的核酸。在一些方面，本公开内容提供了制备核酸(例如，用于测序分析)的方法，其涉及将一个或更多个以捕获部分修饰的核苷酸添加至核酸。在一些实施方案中，该方法还涉及将衔接子核酸与已添加以捕获部分修饰的核苷酸的核酸连接以产生连接产物。在一些实施方案中，该方法还涉及通过使连接产物与以捕获部分修饰的核苷酸的捕获部分的结合配偶体接触来捕获连接产物。在一些实施方案中，该方法还涉及扩增连接产物，例如通过聚合酶链式反应或另外的合适的扩增方法。在一些实施方案中，提供了用于制备核酸的方法，所述核酸涉及将一个或更多个核苷酸添加至包含靶核苷酸序列的核酸(例如，双链核酸)的3’端，其中一个或更多个核苷酸中的至少一个是以捕获部分修饰的核苷酸。在一些实施方案中，在核酸的3’端存在以捕获部分修饰的核苷酸有助于核酸的分离、纯化和/或洗涤，同时避免在整个核酸中并入经修饰的核苷酸(例如，随机地)。在一些实施方案中，提供了用于制备核酸的方法，其涉及将一个或更多个核苷酸并入包含靶核苷酸序列的核酸(例如，双链核酸)中，其中所述一个或更多个核苷酸中的至少一个是以捕获部分修饰的核苷酸。在一些实施方案中，使用引物(例如，逆转录引物)并入一个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，在制备核酸的早起步骤期间并入一个或更多个核苷酸。例如，在一些实施方案中，在片段化、随机引发、第一链合成、第二链合成和/或末端修复期间并入一个或更多个核苷酸。