[发明专利]在基本上无血清的培养基中大规模产生细小病毒H-1的优化的方法

说明书

描述了用于细小病毒生产的优化的方法，包括基本上无血清的培养基，与标准培养基相比该基本上无血清的培养基适用于提高细小病毒的产量，优选用于H‑1PV生产。

技术领域

本发明提供了使用基本上无血清的培养基用于细小病毒生产的方法，与标准培养基相比该基本上无血清的培养基适用于提高细小病毒的产量。

背景技术

H-1PV属于细小病毒科细小病毒亚科的原细小病毒属(Cotmore等人,2014)，其由直径25nm的非包膜二十面体衣壳组成，并且包含编码非结构蛋白-特别是NS1(83kDa)和NS2(25kDa)-以及衣壳蛋白VP1(81kDa)和VP2(65kDa)的约5kb长的单链DNA基因组。另一种衣壳蛋白VPS(63kDa)通过VP2的翻译后切割产生(Faisst等人,1995；Halder等人,2012；Hanson和Rhode,1991；Toolan等人,1960)。原细小病毒以S期依赖的方式复制，并且在容许细胞(permissive cell)感染后经历裂解循环(Burnett等人,2006)。

虽然H-1PV的天然宿主是大鼠，但是因为它优先在转化的细胞(包括许多人肿瘤细胞)中复制，最近该病毒引起了很大的兴趣。因此已经在各种细胞培养基和动物模型中证实了该病毒具有溶瘤和抑瘤特性((Nuesch等人,2012；Rommelaere等人,2010)。在异种移植模型中，H-1PV已经表现出抑制许多人肿瘤，包括宫颈肿瘤(Faisst等人,1998；Li等人,2013)、胰腺肿瘤(Angelova等人,2009b；Grekova等人,2011)、乳腺癌(Dupressoir等人,1989)、胶质瘤(Geletneky等人,2010；Kiprianova等人,2011)和淋巴瘤(Angelova等人,2009a)。另外，已经证明H-1PV在消除癌症干细胞中取得了成功(EP 2 404 609 A1)。基于设想的这些临床前证明，针对患有复发性多形性胶质母细胞瘤的患者于2011年启动了H-1PV的第一次(I/IIa期)临床试验(Geletneky等人,2012)。

为了测试并且最终利用H-1PV的治疗潜力，有必要在适用于临床前或临床应用或基础研究的培养基中优化纯化病毒(载体)原种(stock)的产生。

然而，细胞培养基制剂已经在文献中充分记载并且许多培养基是可商购获得的。H-1PV产生是在各种细胞培养物(诸如，人NB-324K细胞)中使用标准的细胞培养基常规进行的。

除了基本的营养物质外，人细胞体外培养的要求还包括一系列复杂的生长因子(Werner等人,1993)。对具有动物血清的标准细胞培养基进行补充对细胞生长、代谢和刺激增殖至关重要。最广泛使用的血清是成年动物或新生动物的牛血清，或10-20％v/v范围内的胎儿来源的牛血清。胎牛血清(FBS)是细胞附着、生长和增殖所需的大部分因子的混合物，并且因此用作对大多数类型的人细胞和动物细胞有效的几乎通用的生长补充剂(WO2011/157447 A2；Allaume等人,2012)。然而，动物血清在细胞培养中的使用还具有许多缺点。这些缺点可以从细胞生物学的观点看出，因为，血清大体上是培养基中组分不确定的混合物。此外，对于人治疗剂的生物技术产生，动物来源的组分不能在培养方案中应用。例如，存在培养基或从其纯化的产品可能具有免疫原性的风险，特别是如果补充剂源自与待培养细胞源不同的细胞并且诱导免疫反应。

许多无血清培养基制剂是可商购获得的，诸如设计成支持内皮细胞培养的那些(WO 2012/033328 A2)。无血清培养基的蛋白含量低于补充有血清的培养基，这可以简化纯化过程，提高终产物的产率，引入改进的细胞培养条件的控制、提高的批次间一致性以及用于特定细胞类型的优化的制剂。此外，细胞培养基的特性和组成取决于具体的细胞需求。重要参数包括渗透压、pH和营养制剂。