[发明专利]聚乙二醇化的猪干扰素及其使用方法

说明书

本文公开了猪干扰素α变体(pINF‑α)，其包含在pINF‑α中的选择位置的合成氨基酸和在除去信号肽后的N‑末端中的一个或两个氨基酸插入。pINF‑α变体可进一步被聚乙二醇化。还提供制备这些化合物和施用这些化合物以治疗猪中的病毒感染的方法和包含所述变体的制剂。

本申请包含序列表，该序列表已经经由EFS-Web以ASCII格式提交且其全部内容通过引用并入本文。2017年6月15日创建的所述ASCII拷贝命名为204257_0028_561478_SL_ST25.txt且大小为45,280字节。

施用干扰素α(INF-α)具有需要评估和管理的医学后遗症。例如，自身免疫也可通过人类中的慢性病毒性肝炎的INF-α疗法诱导。因此，通常人类治疗限于需要疗法的患者，因为疗法可加重预先存在的自身免疫，暴露沉默的自身免疫过程，或甚至诱导从头自身免疫疾病。F.L. Dumoulin等人, “Autoimmunity induced by interferon-α therapy forchronic viral hepatitis,”  Biomed.  Pharmacother., 53: 242-54 (1999)。还观察到干扰素-α不能治疗人类中的丙型肝炎病毒感染。

就两种聚乙二醇化形式的干扰素α(INF-α)即聚乙二醇干扰素-α-2a和聚乙二醇干扰素-α-2b(也分别称为PEGASYS®和PEGINTRON®)现在正在临床用于人类来说，已经看到干扰素对治疗一些具有丙型肝炎病毒(HCV)的人类有效。然而，尚不清楚INF-α如何抑制HCV复制。更有趣的是，与其天然(野生型)形式相比，聚乙二醇干扰素-α-2a和聚乙二醇干扰素-α-2b分别仅具有7%和28%活性。

在制备干扰素的过程中，已经为人类治疗形成各种变体以延长生物利用度并有助于蛋白质生产。一个实例是在美国专利号8,106,160中，其讨论将一个或多个氨基酸残基添加到成熟人干扰素α-2b的N-末端半胱氨酸以减少非天然二硫键的形成，从而降低结构同种型的水平。这包括在N-末端添加脯氨酸残基。

用于引入插入蛋白质中的位点的非天然氨基酸的方法描述于例如WO2010/011735和WO2005/074650中。

野生型猪干扰素α-1为189个氨基酸长且位于GenBank X57191

需要用于动物和畜牧业，特别是用于治疗易受病毒感染的猪群，且甚至更特别地用于治疗具有活跃和持续病毒感染的猪群以保护猪群免于与病毒感染相关的病理学的干扰素-α的形式。有益的是找到用于猪动物的IFN-α变体，其长效且可用于抑制或减少与病毒感染相关的病毒复制、畜群病理学和动物死亡。猪IFN-α变体会保持生物活性，具有更长的生物利用度且具有很少的同种型，从而允许更容易的纯化。

图1描绘具有pIFN-α-PS-E107amber的质粒pKG0083，其包括脯氨酸-丝氨酸N-末端插入。该质粒通过AXID2820细胞系指引SEQ ID NO：14的蛋白质变体的产生。

图2描绘具有取代残基Q102、E103、E107、L112和Y136的合成氨基酸pAF的pINF-α变体的序列比对和序列标识符。序列都缺少pINF-α的信号序列。该序列在N-末端缺少另外的氨基酸(SEQ ID NO：6、9、12、15和18)，或具有在N-末端添加的脯氨酸(SEQ ID NO：7、10、13、16和19)或脯氨酸-丝氨酸(SEQ ID NO：8、11、14、17和20)。

图3描绘SEQ ID NO：1的基序序列。SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1相同，但包括N-末端甲硫氨酸，其通常在成熟pIFN-α变体的成熟中被切割。SEQ ID NO：3包括信号序列但缺少脯氨酸、脯氨酸-丝氨酸和/或甲硫氨酸的插入。SEQ ID NO：4是野生型成熟pIFN-α。SEQ IDNO：5是在N-末端具有甲硫氨酸的野生型序列。