[发明专利]用于提高核酸的扩增和检测/定量的效率的辅助寡核苷酸

说明书

描述了使用非延伸辅助寡核苷酸检测和定量样品中的靶核酸的改进的方法。所述方法包括使样品中的核酸与扩增试剂接触，所述扩增试剂包括一种或多种引物、一种或多种非延伸辅助寡核苷酸和一种或多种探针。所述非延伸辅助寡核苷酸促进和增加一种或多种引物的靶核酸可达性，导致扩增子生产的更大积累，由此增加扩增测定的效率和灵敏度，包括用于丙型肝炎病毒（HCV）（例如，HCV基因型5）的扩增测定。还提供了试剂盒、制品和反应混合物。

发明领域

本发明涉及体外诊断的领域。在该领域中，本发明涉及改进的用于检测可能存在于样品（例如，生物学或非生物学样品）中的靶核酸的方法。具体地，本发明涉及在增强引物活性的非延伸辅助寡核苷酸的辅助或帮助下对靶核酸的检测和定量。通过增强引物的活性，非延伸辅助寡核苷酸会提高扩增效率，这导致更大的和增强的扩增子生产。因此，所述改进会实现更有效的且更灵敏的检测和定量方法。本发明进一步提供了含有非延伸辅助寡核苷酸、引物和探针的反应混合物和试剂盒，其用于检测和定量可能存在于样品中的靶核酸。本发明对于例如检测和定量样品中的病毒或细菌核酸而言是有用的。

发明背景

在分子诊断领域中，核酸的扩增和检测/定量具有显著的意义和重要性。关于核酸扩增和检测的诊断应用的实例是用于检测和扩增微生物核酸。这样的微生物核酸可以包括细菌核酸和/或病毒核酸。所述扩增和检测/定量技术适合用于病毒核酸靶标，诸如人乳头瘤病毒(HPV)或西尼罗河病毒(WNV)，或针对人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)的存在的常规献血筛查。所述扩增和检测/定量技术也适合用于细菌核酸靶标或肿瘤学标志物等的分析。

最卓越的和广泛使用的用于扩增（和检测/定量）核酸靶标的方法是聚合酶链式反应（PCR）。其它扩增技术包括连接酶链式反应、聚合酶连接酶链式反应、Gap-LCR、修复链式反应、3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和Qβ-扩增。

用于基于PCR的分析的自动化系统经常利用在同一个反应容器中在PCR过程中的产物扩增的实时检测。这样的方法的关键是使用携带报告基团或标记的经修饰的寡核苷酸。PCR利用聚合酶(美国专利号4,683,195和4,683,202)。有关的重要改进是，例如，在利用经修饰的寡核苷酸的PCR过程中扩增产物的实时检测，所述经修饰的寡核苷酸携带被称作水解或5’-核酸酶探针的报告基团或标记，诸如用在COBAS®TaqMan®上的商业测定中(美国专利号5,210,015和5,487,972)。其它改进的扩增和检测方法被称作分子信标（Molecular Beacons）技术(国际专利公开号WO 95/13399)或利用包含小沟结合剂(MGB)部分的寡核苷酸的方法(国际专利公开号WO 03/062445和WO 2006/135765)。进一步已知，含有添加的寡核苷酸的引物（在这些引物中的至少一种的5’末端处具有高GC含量）的应用表现出扩增效率的提高(Liu, 等人, Genome Research 7:389-398 (1997)；国际专利公开号WO 01/94638；和美国专利公开号US 2004/0110182)。在大约12-40个PCR循环以后扩增产物的最终量对于例如已经在5’末端添加GGAC单元的引物而言显著高于未修饰的引物。

Afonina, 等人, BioTechniques 43(3):1-3 (2007)；国际专利公开号WO 2006/135765描述了实时PCR荧光信号的增加，且由此通过使用具有随机地分散在5’末端处的短的富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的翼（flap）的引物和小沟结合剂(MGB)荧光杂交探针得到提高的扩增效率。

类似地，Babiel, 等人(美国专利公开号US 2014/0113279)描述了聚N向引物的添加如何可以导致不希望的高分子量产物的形成的减少或抑制，由此避免假阴性或假阳性结果。

因而，本领域中总是需要对现有方法的改进。例如，本领域中需要提供一种用于简单地和可靠地检测和定量核酸靶标的方法。特别需要提高DNA扩增和检测/定量的效率。