[发明专利]核酸扩增过程中的改进或与核酸扩增过程相关的改进

说明书

披露了一种进行非等温核酸扩增反应的方法，该方法包括以下步骤：(a)在允许杂交事件的条件下将靶标序列与一种或多种互补单链引物混合，其中这些引物与该靶标杂交，该杂交事件直接或间接导致形成包含两个切口位点的双链体结构，这两个切口位点位于该双链体的相反两端处或附近；并通过以下步骤执行扩增过程；(b)在该双链体的链中的每个所述切口位点处产生切口；(c)使用聚合酶延伸带切口的链以便形成新合成的核酸，该延伸用聚合酶重新产生切口位点；(d)根据需要重复步骤(b)和(c)，以便导致产生该新合成的核酸的多个拷贝；其特征在于，执行该方法的温度是非等温的，并且在步骤(b)‑(d)的该扩增过程中经历至少2℃的降低。

技术领域

本发明涉及一种扩增核酸的方法和执行该方法的设备。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是第一种用于扩增DNA的广泛使用的体外方法。尽管非常强大，但该技术需要使用热循环设备使反应混合物经历周期性的温度变化以便实现扩增。因此，PCR并不特别适合在实验室环境之外使用，例如在护理点(“PoC”)诊断装置的背景下。

设计了许多不同的等温扩增技术部分地克服了这个缺点，这些技术避免了对热循环的需要。此类技术包括例如：信号介导的RNA扩增技术(“SMART”；WO 99/037805)；基于核酸序列的扩增(“NASBA”Compton 1991Nature 350,91-92(Compton，1991年，《自然》，第350卷，第91-92页))；滚环扩增(“RCA”，例如参见Lizardi etal.,1998Nature Genetics 19,225-232(Lizardi等人，1998年，《自然遗传学》，第19卷，第225-232页)；环介导的扩增(“LAMP”参见Notomi et al.,2000Nucl.Acids Res.28,(12)e63(Notomi等人，2000年，《核酸研究》，第28卷第12期，第e63页)；重组酶聚合酶扩增(“RPA”参见Piepenberg et al.,2006PLoS Biology 4(7)e204(Piepenberg等人，2006年，《PLoS生物学》，第4卷第7期，第e204页)；链置换扩增(“SDA”)；解旋酶依赖性扩增(“HDA”Vincent et al.,2004EMBORep.5,795-800(Vincent等人，2004年，《欧洲分子生物学会报告》，第5卷，第795-800页))：转录介导的扩增(“TMA”)，单引物等温扩增(“SPIA”参见Kurn et al.,2005ClinicalChemistry 51,1973-81(Kurn等人，2005年，《临床化学》，第51卷，第1973-1981页))；自主序列复制(“3SR”)；以及切口酶扩增反应(“NEAR”)。

SDA是这样一种技术(由Walker et al.,1992Nucl.Acids Res.20,1691-1696(Walker等人，1992年，《核酸研究》，第20卷，第1691-1696页)披露)，它涉及使用在包含靶标互补部分的一对引物的上游的一对短“缓冲”引物以及在该靶标互补部分的5’的用于核酸内切酶的识别及切割位点。“缓冲”引物通过产生用于引物扩增的互补单链靶标来帮助引发SDA反应。引物与相应的互补单链靶标分子杂交。使用包含DNA聚合酶和至少一种经修饰的核苷三磷酸的反应混合物，使用引物作为模板来延伸靶标链的3'末端(同样地，使用靶标作为模板来延伸引物的3'末端)。