[发明专利]一步逆转录模板转换PCR

说明书

本发明提供了用于更快、更容易，且具有高特异性地进行一步逆转录模板转换PCR的技术。本发明提供了使用经修饰的寡核苷酸引物扩增RNA的至少一部分区域的核酸扩增方法，所述核酸扩增方法的特征如下：核酸扩增反应包括逆转录步骤a)，其中RNA用作模板，模板转换步骤b)，其中将模板转换寡核苷酸加入到步骤a)中合成的cDNA中，和DNA扩增步骤c)，其中通过PCR进行DNA扩增，其中步骤b)中合成的模板转换cDNA用作模板；步骤a)至c)在同一反应体系中的单个阶段中进行；该经修饰的寡核苷酸在逆转录步骤a)中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并在DNA扩增步骤c)中清除引物功能的封闭。

技术领域

本发明涉及以一步进行逆转录模板转换PCR的技术。

背景技术

逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction；RT-PCR)作为一种使用RNA为模板扩增特定基因的方法，广泛用于基因工程领域。在RT-PCR中，首先使用逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)将RNA逆转录成cDNA，然后通过耐热DNA聚合酶扩增至该cDNA可检测水平。虽然这种反应组合通常分两步进行(每个反应使用一个单独的管并连续反应)，但正在开发通过改进逆转录酶或反应溶液成分来以一步完成该反应组合(在单个管中连续反应)的技术。

模板转换(Template Switching)是一种即使模板RNA的5'末端的序列是未知的或缺乏共有序列，也能使用RNA为模板进行RT-PCR扩增的技术。在模板转换中利用这样一种现象：当逆转录酶到达模板RNA的5'末端时，通过逆转录酶的末端转移酶活性将短的特异性序列(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)来源的逆转录酶(MMLVRT)的富含胞嘧啶的短序列)自动添加到新合成的cDNA的3'末端。如果在逆转录时将在锚定序列的3'末端添加有与该短添加序列互补的序列的寡核苷酸(模板转换寡核苷酸)添加到体系中，则该模板转换寡核苷酸与合成的cDNA3'末端杂交以延伸用于逆转录酶的模板。由于逆转录酶转换模板继续cDNA合成到锚定序列的5'末端，将与锚定序列互补的序列添加到cDNA的3'末端。通过使用包含与模板RNA中的特定序列互补的序列的寡核苷酸DNA或在5'末端添加有特定已知序列的寡核苷酸DNA作为逆转录引物，新合成的cDNA在5'末端也具有已知序列，结果，新合成的cDNA(反义链)在5'末端和3'末端都将包含已知序列。因此，使用基于这些已知序列设计的引物组能够进行PCR扩增。

通过使用随机引物或含有与poly-(A)尾互补的oligo(dT)引物的逆转录，实现对应于具有poly-(A)尾的mRNA的cDNA的合成。在该反应中，从所有具有poly-(A)尾的mRNA合成cDNA，从而构建cDNA文库。同时，在逆转录中通过使用对特定基因特异的引物，可以仅特异性合成特定基因的cDNA。

需要一种用于以更高的特异性更快和更简单地进行逆转录模板转换PCR的技术，使得PCR可以应用于高通量操作。

同时，已经开发了各种热启动技术作为用于避免PCR中的副反应的技术。换句话说，进行PCR时，从制备反应溶液直到热循环仪的温度升高，PCR反应混合物暴露在室温至50℃的温度下。由于引物的Tm通常被设置为50℃以上，因此在该温度范围内不能充分展现引物的特异性。同时，聚合酶在该温度范围内展现出活性(尽管是弱活性)，导致以错误退火的引物为起点的延伸，成为引起各种副反应(引物二聚体、额外条带等)的原因。作为避免这种副反应的技术，正在开发与不耐热修饰基团结合的寡核苷酸引物(专利文献1和2，以及非专利文献1和2)。在该寡核苷酸引物中，在3'末端羟基或者一个以上的核苷酸间键有修饰基团取代。由于该修饰基团的保护，在PCR扩增中的第一个高温孵育期之前抑制DNA聚合酶介导的寡核苷酸引物延伸。由于存在修饰基团，引物在达到第一变性温度(在大多数情况下为95℃)之前是无活性的。在达到第一变性温度后，修饰基团脱离，从而成为能够通过聚合酶延伸的相应的未经修饰的寡核苷酸引物。

[引用列表]

[专利文献]