[发明专利]一步逆转录模板转换PCR

权利要求书

1.一种扩增靶RNA的至少一部分区域的方法，所述方法包括以下步骤：

a)混合所述靶RNA、逆转录所需的试剂、模板转换所需的试剂和聚合酶链反应所需的试剂，并使混合物经历发生逆转录的条件以提供cDNA，所述cDNA包含模板转换寡核苷酸以及与所述靶RNA对应的核酸序列；和

b)使步骤a)中获得的所述cDNA经历发生聚合酶链反应的条件，以扩增所述cDNA的至少一部分区域；

其中，所述聚合酶链式反应所需的试剂包含经修饰的寡核苷酸引物，所述经修饰的寡核苷酸引物设计成在步骤a)中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在步骤b)中清除引物功能的封闭。

2.一种产生基于靶RNA的至少一部分区域扩增的核酸样品的方法，所述方法包括以下步骤：

a)混合所述靶RNA、逆转录所需的试剂、模板转换所需的试剂和聚合酶链反应所需的试剂，并使混合物经历发生逆转录的条件以提供cDNA，所述cDNA包含模板转换寡核苷酸以及与所述靶RNA对应的核酸序列；和

b)使步骤a)中获得的所述cDNA经历发生聚合酶链反应的条件；

其中，所述聚合酶链式反应所需的试剂包含经修饰的寡核苷酸引物，所述经修饰的寡核苷酸引物设计成在步骤a)中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在步骤b)中清除引物功能的封闭。

3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述聚合酶链反应所需的试剂根据需要包含5'锚定寡核苷酸引物，所述5'锚定寡核苷酸引物含所述模板转换寡核苷酸中所包含的锚定序列的至少一部分。

4.权利要求3所述的方法，其中，所述聚合酶链反应所需的试剂不包含所述5'锚定寡核苷酸引物。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述逆转录所需的试剂包含使逆转录开始的寡核苷酸引物，并且所述使逆转录开始的寡核苷酸引物以约40nM以下的终浓度，或相对于所述经修饰的寡核苷酸引物约10分之1以下的摩尔比包含在所述混合物中。

6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物在同一经修饰的寡核苷酸引物的序列上具有一个或更多个互补区域，并且在PCR的初期热变性之前通过所述互补区域具有转角结构，或包含不耐热的修饰基团。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物包含与模板RNA的一部分序列互补的核苷酸序列。

8.权利要求7所述的方法，其中，引物功能尚未被封闭的一部分的所述经修饰的寡核苷酸引物起到通过与所述模板RNA杂交而使逆转录开始的寡核苷酸引物的作用。

9.用于扩增靶RNA的至少一部分区域的试剂盒，所述试剂盒包括：

i)逆转录所需的试剂；

ii)模板转换所需的试剂；

iii)使用经修饰的寡核苷酸引物进行聚合酶链反应所需的试剂；和

iv)根据需要，用户手册；

其特征在于，在反应开始时，将所述i)至iii)的试剂和所述经修饰的寡核苷酸引物全部混合在反应体系中，所述经修饰的寡核苷酸引物设计成在发生逆转录的条件下引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在发生聚合酶链反应的条件下清除引物功能的封闭。

10.权利要求9所述的试剂盒，其中，所述模板转换所需的试剂包含模板转换寡核苷酸，并且所述聚合酶链反应所需的试剂根据需要包含5'锚定寡核苷酸引物，所述5'锚定寡核苷酸引物含所述模板转换寡核苷酸中所包含的锚定序列的至少一部分。

11.权利要求10所述的试剂盒，其中，所述聚合酶链式反应所需的试剂不包含5'锚定寡核苷酸引物。