[发明专利]环状DNA的扩增方法

说明书

本发明提供可在无细胞系统中简便并且指数扩增环状DNA、特别是长链环状DNA的方法。具体而言，提供环状DNA的扩增方法，其包括使有复制起始序列(origin of chromosome(oriC))的环状DNA与含以下的酶组反应：(1)催化环状DNA的复制的第一酶组；(2)催化冈崎片段连接反应而合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶组；及(3)催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶组，以及缓冲液、NTP、dNTP、镁离子源、及碱金属离子源的反应液混合而生成的反应混合物。

【技术领域】

本发明涉及环状DNA的扩增方法。更具体而言，涉及可在无细胞系统中指数扩增环状DNA的方法。

【背景技术】

成为生物技术发展的基础的DNA克隆技术是使由DNA片段的切割粘贴调制的环状DNA在大肠杆菌等的细胞内作为质粒扩增的方法。在利用使用细胞的DNA克隆技术而扩增环状DNA时，细胞培养及扩增产物的提取－纯化等的烦琐的顺序变得必要。另外，由于有为了进行使用细胞的DNA克隆而制出基因重组生物的必要，可实验的环境上有限制。

作为在试管内扩增DNA的方法，一般使用聚合酶链式反应(PCR)。但是，由利用PCR的试管内DNA扩增法无法直接扩增环状DNA。作为环状DNA的试管内扩增法，有滚环扩增法(RCA)等(非专利文献1、专利文献1、专利文献2、专利文献3)。但是，为了用滚环扩增法扩增环状DNA，有每次设计对目标DNA具有特异性的引物的必要。另外，由滚环扩增法的直接的扩增产物是直链型DNA，为了使得到的扩增产物环化，与重组酶温育等的进一步的环化工序变得必要。也报告了在复制大肠杆菌的小染色体(oriC环状DNA)之后，将其分离，得到单体的环状复制产物的方法(非专利文献2～5)。但是，在这些文献中使用的反应条件中，实验显示作为环状DNA分子的复制效率止于所加的模板DNA的15-40％左右，作为扩增量未达倍增(非专利文献3～6)。再者，在这些文献中作为模板使用的环状DNA的尺寸止于不足10kbp。

这样，为了用以往的试管内DNA扩增法扩增环状DNA，引物向模板DNA的结合是必要的，扩增产物是直链型DNA，另外，能扩增的DNA尺寸止于数kbp。再者，在要使用大肠杆菌小染色体复制系统来产生环状的扩增产物时，有模板环状DNA不扩增翻倍的问题。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：特开2005-229950

专利文献2：特开2008-161182

专利文献3：特表2012-501173

【非专利文献】

非专利文献1：Fakruddin M et al.、J Pharm Bioallied Sci.2013、5：245-252

非专利文献2：Peng HMarians KJ.PNAS.1993、90：8571-8575

非专利文献3：Hiasa HMarians KJ.J Biol Chem.1994、269：32655-32659

非专利文献4：Funnell B et al.、J Biol Chem.1986、261：5616-5624

非专利文献5：Hiasa H et al.、J Biol Chem.1994、269：2093-2099

非专利文献6：Hiasa HMarians KJ.J Biol Chem.1994、269：26959-26968

【发明的概要】

【发明要解决的课题】

本发明旨在提供可在无细胞系统中简便并且指数扩增环状DNA、特别是长链环状DNA的方法。