[发明专利]环状DNA的扩增方法

权利要求书

1.环状DNA的扩增方法，其包括以下的工序：

(1)形成成为模板的环状DNA和含以下物质的反应液的反应混合物的工序：

催化环状DNA的复制的第一酶组；

催化冈崎片段连接反应而合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶组；

催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶组；

缓冲液；

ATP；

GTP、CTP及UTP；

dNTP；

镁离子源；及

碱金属离子源，

其中所述环状DNA含能与有DnaA活性的酶结合的复制起始序列(origin ofchromosome(oriC))；及

(2)将在工序(1)中形成的反应混合物在重复30～80℃的温育及10～27℃的温育的温度循环下温育的工序。

2.权利要求1所述的方法，其中反应液还含蛋白质的非特异吸附抑制剂、及/或核酸的非特异吸附抑制剂。

3.权利要求1所述的方法，其中反应液还含直链状DNA特异性外切核酸酶及/或RecG型解螺旋酶。

4.权利要求1所述的方法，其中反应液还含铵盐。

5.权利要求1所述的方法，其中

第一酶组含具有DnaA活性的酶、1种以上的核样体蛋白质、有DNA促旋酶活性的酶或酶组、单链DNA结合蛋白质(single-strand binding protein(SSB))、有DnaB型解螺旋酶活性的酶、有DNA解螺旋酶装载体活性的酶、有DNA引发酶活性的酶、有DNA夹活性的酶、及有DNA聚合酶III*活性的酶或酶组的组合，

第二酶组含具有DNA聚合酶I活性的酶及有DNA连接酶活性的酶的组合，

第三酶组含具有拓扑异构酶III活性的酶及/或有拓扑异构酶IV活性的酶。

6.权利要求5所述的方法，其中第二酶组还含具有RNA酶H活性的酶。

7.权利要求5所述的方法，其中第三酶组还含具有RecQ型解螺旋酶活性的酶。

8.权利要求5所述的方法，其中在第一酶组中，

1种以上的核样体蛋白质是IHF或HU，

有DNA促旋酶活性的酶或酶组是由GyrA及GyrB构成的复合物，

有DnaB型解螺旋酶活性的酶是DnaB解螺旋酶，

有DNA解螺旋酶装载体活性的酶是DnaC解螺旋酶装载体，

有DNA引发酶活性的酶是DnaG引发酶，

有DNA夹活性的酶是DnaN夹，

有DNA聚合酶III*活性的酶或酶组是含DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ、及HolE之任一者的酶或酶组。

9.权利要求1所述的方法，其中反应液还含RecG型解螺旋酶及/或单链DNA特异性外切核酸酶。

10.权利要求1所述的方法，其中反应液还含直链状DNA特异性外切核酸酶及/或单链DNA特异性外切核酸酶。

11.权利要求1所述的方法，其中反应液还含DNA的稳定化因子。

12.权利要求1所述的方法，其中工序(1)包括：

(1-1)对含以下物质的反应液进行预温育的工序：

催化环状DNA的复制的第一酶组；

催化冈崎片段连接反应而合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶组；

催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶组；

缓冲液；

ATP；

GTP、CTP及UTP；

dNTP；

镁离子源；及

碱金属离子源；及

(1-2)形成所述反应液和成为模板的环状DNA的反应混合物的工序。