[发明专利]miRNA转录组方法和组合物

说明书

公开了用于富集长度在所需目标长度范围内的短多核苷酸分子的方法、多核苷酸、试剂盒和反应混合物。IIS型或III型限制酶用于在位于距限制酶识别位点一定距离的切割位点切割多核苷酸。例如，可以通过将DNA分子插入限制酶的识别位点和阻断限制酶切割的非天然存在的核苷酸区域之间来形成多核苷酸的混合物。如果多核苷酸含有长度在目标范围内的DNA分子，那么切割位点将在阻断区域内，并且不会发生切割。可以切割含有长度在目标范围之外的DNA分子的多核苷酸。通过用PCR或其他方法选择性富集完整的多核苷酸，可以形成具有目标长度的多核苷酸浓缩群。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年4月27日提交的美国临时申请号62/328,504的权益，该申请通过引用全文纳入本文用于所有目的。

背景技术

小RNA是一类RNA分子，其长度通常小于250个核苷酸，并且不编码用于翻译成蛋白质。这些分子通常在细胞内发挥调节作用，与编码RNA相互作用以影响它们的翻译。这种小RNA的示例类型包括但不限于miRNA，snoRNA和piRNA。

miRNA是单链非编码RNA分子，其含有约22个核苷酸并且在转录后基因表达和基因沉默的调节中起作用。作为该活性的结果，miRNA群的分析是研究例如基因调控，疾病发展，分子诊断和药物遗传学的重要工具。

为了通过例如miRNA-seq，miRNA RT-qPCR或miRNA微阵列分析miRNA分子的转录组群，生物样品中存在的miRNA经常必须使用诸如尺寸选择凝胶电泳的技术富集。生产miRNA文库的替代方案包括使用miRNA特异性扩增反应或杂交探针。用于富集miRNA或其他小多核苷酸的这些和其他选择通常是耗时的或难以应用于小样品，例如衍生自单个细胞的那些样品。

发明内容

通常，本文提供用于富集长度在目标范围内的短多核苷酸分子的方法、试剂盒和材料。

提供的一种多核苷酸包含DNA序列，包含许多连续的非天然存在的核苷酸的第一衔接子寡核苷酸，和包含IIS型或III型限制酶的识别位点的第二衔接子寡核苷酸。第一和第二衔接子寡核苷酸与DNA序列的相对末端连接。如果DNA序列具有在目标长度范围内的长度，则连续的非天然存在的核苷酸的数量足以阻断IIS型或III型限制酶的切割。

在一些实施方式中，DNA序列具有目标范围内的长度。

在一些实施方式中，DNA序列的长度小于目标长度范围的最小值或大于目标长度范围的最大值。

在一些实施方式中，DNA序列包含cDNA。

在一些实施方式中，DNA序列包含通过miRNA的逆转录形成的cDNA。

在一些实施方式中，DNA序列包含通过siRNA的逆转录形成的cDNA。

在一些实施方式中，识别位点用于IIS型限制酶。

在一些实施方式中，识别位点用于III型限制酶。

在一些实施方式中，III型限制酶是EcoP15I。

在一些实施方式中，第一或第二衔接子寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸。

在一些实施方式中，连续的非天然存在的核苷酸的数量为3至20。

在一些实施方式中，非天然存在的核苷酸包含硫代磷酸化的碱基。

在一些实施方式中，目标长度范围为18至24个碱基对。

在一些实施方式中，第一和第二衔接子寡核苷酸各自还包含引物结合位点。

提供的一种用于富集来自样品的短多核苷酸序列的试剂盒包含IIS型或III型限制酶，和包含多个连续的非天然存在的核苷酸的第一衔接子寡核苷酸。