[发明专利]采用双探针邻近性连接系统的多重单分子RNA可视化

权利要求书

1.一种用于测定单细胞中的靶核酸的丰度的方法，所述方法包括：

使固定和透化过的细胞与至少一对SNAIL寡核苷酸引物在容许特异性杂交的条件下接触，其中所述引物对包含夹板引物寡核苷酸(SPO)和挂锁寡核苷酸(PO)，其中SPO和PO各自包含与所述靶核酸上的相邻序列互补的第一互补区(分别为CR1和CR1’)；且SPO和PO各自进一步包含位于邻近CR1或CR1'的第二互补区(CR2和CR2’)；其中CR2’是割裂区以使得PO的5’和3’端与CR2杂交，以便在杂交之后，PO的5’和3’端直接定位成彼此相邻；

洗涤不含未结合的引物的细胞；

使所述细胞与连接酶接触，其中连接所述PO以生成闭合环；

使用所述PO作为模板和SPO作为聚合酶的引物来进行滚环扩增；

使所述细胞与检测探针在容许特异性杂交的条件下接触；以及

检测结合的检测探针的水平以测定所述靶核酸的丰度。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述SNAIL寡核苷酸引物对在接触样品之前通过加热而变性。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞存在于细胞群中。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述细胞群包含多种细胞类型。

5.如权利要求1所述的方法，其中使用对不同的靶核酸具有特异性的多个SNAIL寡核苷酸引物。

6.如权利要求5所述的方法，其中检测到至少5种不同的靶核酸。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是RNA。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述RNA是mRNA。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是DNA。

10.如权利要求1所述的方法，其中对所述细胞的一种或多种非核酸标志物的表达同时进行分析。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种标志物是蛋白质标志物。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述检测探针用荧光团、同位素或质量标签中的一种或多种标记。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述检测通过以下手段进行：流式细胞术；测序；探针结合和电化学检测；pH改变；由结合至DNA标签的酶诱导的催化；量子纠缠；拉曼光谱学；太赫波技术；或扫描电子显微术。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述流式细胞术是质谱流式细胞术或荧光激活流式细胞术。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述检测通过显微术、扫描质谱法或其它成像技术进行。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述检测通过纳米SIMS进行。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述SNAIL寡核苷酸中的一个或多个的序列提供关于鉴别供用于多重分析的所述靶核酸的条形码信息。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述PO作为闭合环提供，且省去使所述细胞与连接酶接触的步骤。

19.如权利要求1所述的方法，其中选择反应中的探针的Tm以使溶液中的连接最少。

20.如权利要求1所述的方法，其中在检测之后移除所述检测探针。