[发明专利]单核苷酸检测方法

权利要求书

1.核酸测序方法，其特征在于以下步骤：(1)通过所述核酸的渐进的焦磷酸解产生单核苷酸流；(2)通过在聚合酶和连接酶存在下使所述单核苷酸之一与相应的探针系统反应产生至少一个基本上双链的寡核苷酸已用探针，所述探针系统包含(a)第一单链寡核苷酸，其标记有处于不可检测状态的特征性可检测元件类型的第一和第二区，所述第一和第二区分别位于第三区的X’和Y’侧，所述第三区包含包括捕获位点的限制性酶识别位点元件和在其X’侧的外切核酸酶阻断位点(其中X’为3’并且Y’为5’或X’为5’并且Y’是3’)，和(b)第二和第三单链寡核苷酸，其能够与所述第一寡核苷酸上所述捕获位点侧翼的互补区杂交；(2a)(i)当且仅当捕获的单核苷酸包含被取代的核碱基时，用常规或切口取代依赖性限制性内切核酸酶处理所述已用探针以在所述识别位点切割所述第一寡核苷酸链，或(ii)当且仅当捕获的单核苷酸包含未取代的核碱基时，用常规或切口取代敏感性限制性内切核酸酶处理所述已用探针以在所述识别位点切割所述第一寡核苷酸链；(3)用在对应于所述第一寡核苷酸的X’-Y’方向上具有双链外切核酸活性的酶消化所述已用探针的第一寡核苷酸链以产生处于可检测状态的来自所述第一区，所述第二区，或所述第一和第二区的可检测元件和单链第四寡核苷酸，所述单链第四寡核苷酸至少部分是所述第一寡核苷酸的互补序列；(4)使所述所述第四寡核苷酸与另一个第一寡核苷酸反应以产生对应于已用探针的基本上双链的寡核苷酸产物；(5)在循环中重复步骤(2a)，(3)和(4)，并且(6)检测在步骤(3)的每次重复中释放的可检测元件，其中如果使用的内切核酸酶是常规类型，则所述第二或第三寡核苷酸分别在其X’或Y’端或其附近包括引导内切核酸降解的连接。

2.权利要求1的方法，其特征在于所述第二寡核苷酸的Y’端和所述第三寡核苷酸的X’端通过接头区连接。

3.权利要求2的方法，其特征在于所述接头区包含寡核苷酸区。

4.权利要求2或3的方法，其特征在于产生的第四寡核苷酸包含闭环。

5.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述第二寡核苷酸(a)与捕获区的X’侧的侧翼区杂交并且(b)长于所述侧的所述区。

6.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于在所述第一寡核苷酸的3’端和所述第二或第三寡核苷酸的相应区之间存在至少一个核苷酸碱基错配。

7.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述可检测元件类型是荧光团类型，至少一种淬灭剂的存在使得所述荧光团类型在所述第一寡核苷酸中是不可检测的。

8.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于检测的取代的单核苷酸三磷酸包括甲基化的胞嘧啶或甲基化的腺嘌呤核苷酸碱基。

9.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤(2a)和(3)在不同温度进行。

10.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述探针系统包括多个第一寡核苷酸类型，其各自设置有不同的捕获区和特征性的第一或第一和第二可检测元件类型。

11.权利要求10的方法，其特征在于使用多达四组不同的寡核苷酸探针系统，每组的第一寡核苷酸具有对天然存在的DNA或RNA的特征核苷酸碱基之一有选择性的捕获区和不同的第一或成对的第一和第二可检测元件类型。

12.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤(1)还包括在相应的微滴中含有每种单核苷三磷酸，并且在每个微滴中进行步骤(2)-(6)和(2a)。

13.权利要求12的方法，其特征在于使通过将步骤(6)应用于每个微滴获得的结果集合成表征所述核酸的序列的数据流。