[发明专利]具有降低的背景的基于光学的纳米孔分析

说明书

本发明涉及包含不透明层的纳米孔阵列，所述不透明层降低在应用此类阵列用于分析分子中收集的光学信号中的背景荧光。在一些实施方案中，此类阵列用于在包括以下步骤的方法中确定聚合物诸如多核苷酸的特征：使聚合物易位穿过所述阵列的纳米孔，其中聚合物具有一个或更多个光学标记物，激发从所述不透明层向激发光束的方向延伸的每个纳米孔的信号生成区中的聚合物的光学标记物，检测来自每个纳米孔的信号生成区的光学信号以确定穿过其易位的聚合物的特征。

本申请要求2016年1月15日递交的美国临时专利申请第62/279,503号和2016年3月14日递交的美国临时专利申请第62/308,145号的优先权权益，其各自通过引用整体并入本文。

背景

过去十年发展的DNA测序技术已经改变了生物科学，例如van Dijk等,Trends inGenetics,30(9):418-426(2014)。然而，要实现技术的全部潜力，仍必须克服一系列挑战，包括降低每次运行测序成本、简化样品制备、缩短运行时间、增加序列读段长度、改进数据分析等。单分子测序技术，诸如基于纳米孔(nanopore)的测序，可以解决这些挑战中的一些；然而，这些方法具有其自身的一组技术难题，诸如可靠的纳米结构制造、DNA易位速率的控制、明确的核苷酸鉴别、来自纳米级传感器的大阵列的信号的检测和处理等，例如Branton等,Nature Biotechnology,26(10):1146-1153(2008)。

已经提出核苷酸的光学检测作为纳米孔测序领域中的一些技术难题(例如难以从纳米孔的大阵列收集独立信号)的潜在解决方案。然而，对于基于荧光的信号，克服单分子光学检测中的背景噪声仍然是重大挑战。这导致经常使用显微镜系统，诸如全内反射荧光(TIRF)系统，其使背景激发最小化但增加了检测系统的复杂性和费用。

鉴于以上，如果可以获得使用更简单和更便宜的显微镜系统解决单分子分析的背景问题的方法和装置，则对纳米孔传感器技术整体及其具体应用(诸如基于光学的纳米孔测序)是有利的。

发明概述

本发明涉及使用光学标记物和纳米孔进行单分子分析的方法和装置。在一个方面，本发明的方法和装置涉及降低在标记的聚合物分析物易位穿过纳米孔时生成的光学信号中的噪声。

在一些实施方案中，本发明涉及确定聚合物诸如多核苷酸的特征的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含固相膜和与其共同延伸的不透明层的纳米孔阵列，所述纳米孔阵列包括多个孔眼(apertures)并且分隔第一室和第二室，其中每个孔眼提供所述第一室和所述第二室之间的流体连通并具有信号生成区，且其中所述不透明层基本上防止光穿过所述纳米孔阵列；(b)使聚合物从所述第一室穿过所述孔眼易位到所述第二室，每个聚合物具有附接到其上的一个或更多个光学标记物，所述光学标记物能够生成具有指示所述聚合物的特征的至少第一波长的光学信号；(c)当所述聚合物易位穿过所述孔眼的所述信号生成区时，用具有第二波长的激发光束激发所述聚合物的光学标记物，其中检测区中的所述光学标记物生成其第一波长不同于所述第二波长的光学信号；和(d)检测来自所述信号生成区的所述光学标记物的光学信号，以确定所述聚合物的特征。

在一些实施方案中，本发明涉及确定聚合物的特征的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含固相膜的纳米孔阵列，所述固相膜具有第一侧、第二侧和穿过其的多个孔眼，其中所述固相膜分隔第一室和第二室，使得每个孔眼提供所述第一室和所述第二室之间的流体连通，且其中所述固相膜的所述第一侧具有在其上的不透明涂层，且每个孔眼具有从所述第一侧的所述不透明涂层朝向所述第二侧延伸的检测区；(b)使聚合物从所述第一室穿过所述孔眼易位到所述第二室，每个聚合物具有附接到其上的一个或更多个光学标记物，所述光学标记物能够生成具有指示所述聚合物的特征的至少第一波长的信号；(c)从所述固相膜的所述第二侧用具有第二波长的激发光束照射所述孔眼的检测区中的所述光学标记物，使得检测区中的所述光学标记物生成其第一波长不同于所述第二波长的信号；(d)检测来自所述检测区中的所述光学标记物的信号以确定所述聚合物的特征。