[发明专利]判断PCR结果是否为假阳性的方法

说明书

本发明公开一种判断PCR结果是否为假阳性的方法，先估算出在PCR体系内将要加入的目标基因模板分子数量；然后根据目标基因模板分子数量向PCR体系内添加内参模板，所述内参模板的分子数量控制在目标基因模板分子数量的1/n；所述内参模板和目标基因模板高度同源，使得PCR引物能够以相同效率扩增内参模板和目标基因模板，然后对扩增结果进行测序分析；当扩增结果以目标基因片段为主，说明样品为阳性；当扩增结果以内参模板为主，则说明样品为阴性。本发明根据目标基因模板分子数量加入适量的内参模板，一方面能够压制污染信号，其抗污染能力可以达到Southern blot的级别，另一方面，本发明通过简单的PCR技术就可以对转基因阳性进行鉴定，可信度高，成本低廉。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及判断PCR结果是否为假阳性的方法。

背景技术

PCR反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，PCR的最大特点是能在生物体外将微量的DNA大幅增加。PCR技术具有高灵敏性，得到了广泛的应用，但是作为基因检测的必备方案，也存在着缺点，因为其过于灵敏，容易被环境中微量DNA污染，出现假阳性，例如在转基因检测的实验中，因为经常扩增gus,hyg等标记基因，一段时间过后，在不加任何模板的情况下依然能够扩增出这些片段，这是很多生物实验室遇到的头疼的问题，以至于检测结果不可信，不得不再依赖于southern blot技术作为最终的转基因阳性鉴定标准。而southern blot的实验技术要求高，增加实验成本。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种判断PCR结果是否为假阳性的方法，通过前期添加相对少量的内参阳性模板用于压制污染信号，然后对PCR结果进行进一步的分析判断结果是否可信。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

判断PCR结果是否为假阳性的方法，先估算出如果在目标基因存在的情况下，在PCR 体系内将要加入的目标基因模板分子数量；然后根据目标基因模板分子数量向PCR体系内添加内参模板，所述内参模板的加入用于压制污染，所述内参模板的分子数量控制在目标基因模板分子数量的1/n，n为2～1000的自然数；

所述内参模板和目标基因模板高度同源，两者只有个别碱基的差别，使得PCR引物能够以相同效率扩增内参模板和目标基因模板，然后对扩增结果进行测序分析；当扩增结果以目标基因片段为主，说明样品为阳性；当扩增结果以内参模板为主，则说明样品为阴性；当阴性样品被目标模板污染，且污染量不超过预期目标模板数量的1/n，则得到的为可信结果。

优选地，根据添加DNA模板的体积、浓度、以及分子量估算出在PCR体系内将要加入的所述目标基因模板分子数量。例如，检测转基因水稻中是否为阳性转基因植株，水稻基因组DNA浓度X ng/ul可以通过分光光度计测得，水稻基因组约466000000bp，1bp长度的DNA的平均分子量约为650；添加1ul的浓度为X的基因组做模板，添加的目标基因分子的数量N＝X*6.02*10²³/(650*466000000*1000000000),N＝1987*X(约等于2000X) 个；同理内参模板的量可以通过换算获得。

优选地，所述n为3～10。内参模板的加入是为了压制污染，对污染的抵抗能力与设计时使用的内参模板相对于预期目标基因模板的分子数量决定的。如果内参模板加入较多，可以更强的压制污染信号，但是也可能会出现对模板量预估不准的情况下产生假阴性的现象；如果内参模板加入的太少则抗污染能力减弱，优选地设置n＝3～10比较合理,对于目标模板量1/3的污染即使使用southern blot的鉴定方法也无法进行准确鉴定。所以此方案抗污染能力可以到达Southern blot的级别。要想提高抗污染的能力需要尽可能的提高加入目标基因模板的浓度以便可以加入更多的内参模板数量。

优选地，所述测序分析的方法采用一代测序或者二代测序方法。