[发明专利]猪蓝耳病毒荧光EMA检测引物组、试剂盒和检测方法

说明书

本发明涉及一种猪蓝耳病毒荧光EMA检测引物组、试剂盒和检测方法，所述猪蓝耳病毒荧光EMA检测引物组包含检测猪蓝耳病毒基因组Nsp2基因序列的上、下游引物和探针，所述EMA检测试剂盒包括试剂盒A和试剂盒B。所述检测包含使用所述检测试剂盒进行常温核酸扩增技术，通过M‑MLV逆转录酶、Rnase抑制剂、DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶等多个酶促反应，可在37‑45℃恒温条件下，10‑30分钟内使待检RNA逆转录成cDNA，并将cDNA扩增数百万倍，配合荧光检测技术，可以实现对待检RNA的快速检定。本发明操作简单、时间短、仪器要求低，适合用于猪传染性疾病的快速诊断。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪蓝耳病毒荧光EMA检测引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

猪蓝耳病，又称繁殖与呼吸障碍综合症(Porcine Reproductiv and RespiratorySyndrome，PRRS)。主要临床表现为妊娠母猪繁殖障碍，妊娠母猪流产、弱胎、死胎、木乃伊胎；仔猪间质性肺炎等症状。其致病病原为猪蓝耳病病毒(PRRS Virus，PRRSV)，是一种正链小RNA囊膜病毒，基因组长约15kb。分美洲型和欧洲型，我国猪蓝耳病毒属于美洲型；但从2006年以来，我国有25个省份发生了由高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)为主要病原的“猪高热病”。这一病原的传染性极强，呈慢性持续性感染现象，病毒滴度长期维持在较低水平，完全清除至少需要150天。一旦感染猪，会呈现高发病率和高死亡率的特点，给养猪业造成更为严重的经济损失。

如今猪蓝耳病毒的检测主要为PCR法及免疫法，其中免疫法存在特异性不高和灵敏度不强等问题，而PCR法的使用也越来越普及，包括电泳法和荧光法，众所周知电泳法较荧光法多一步电泳，且扩增产物需要打开，增加了污染的风险，所以接受度没有荧光法高，传统的PCR法均需要配备价格高昂的PCR仪或实时荧光定量PCR仪，因此无法用于基层和现场检测。

如中国专利CN 105648119 A，公开了一种检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的引物、试剂盒及方法，其所述的扩增技术需经历50℃到94℃之间多次变温过程，耗时较长，且需要控温精度高的PCR仪，成本相对较高，而扩增之后需要电泳检测，增加了一步繁琐步骤，同时产物需要开盖，增加了污染的风险。

因此，怎样能够满足基层检测用时少、技术和仪器要求低、操作简单方便的需求，成为业内急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪蓝耳病毒荧光EMA检测引物组、试剂盒及检测方法，特异性强，准确率高，操作简单、时间短、仪器要求低，能够实现快速、准确、低成本地检测猪蓝耳病毒。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：猪蓝耳病毒荧光EMA检测引物组，包含检测猪蓝耳病毒基因组Nsp2基因序列的上、下游引物和探针，所述上游引物是：5’-ATYACACGCCCAAAATACTCAGCT-3’；所述下游引物是：5’-CGCCAAGTCAGCATGTCAACC-3’；所述探针是5’-TAAGCTTAGCCGCATCACAAGCCA/iFAMdT//idSp/A/iBHQ1dT/GCTGAGGCAT-3’C3Spacer。其中：“i6-FAMdT”指6-FAM(6-羧基荧光素)荧光标记的dT核苷酸，“idSp”指碱基缺失，“iBHQ1dT”指带有BHQ1淬灭基团标记的dT核苷酸，“C3Spacer”指3’羟基封闭。

其中，所述引物组中的上、下游引物和探针可以是与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者是与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列碱基互补的序列。

本发明还提供猪蓝耳病毒荧光EMA检测试剂盒，所述猪蓝耳病毒荧光EMA检测试剂盒包括试剂盒A和试剂盒B：

所述试剂盒A包含裂解液、洗涤液、洗脱液、含M-MLV逆转录冻干酶的逆转录管；