[发明专利]一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法

说明书

本发明涉及一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法，属于中药鉴定技术领域；本发明将僵蚕样品粉碎后采用CTAB法同时提取家蚕和菌物中的DNA，并以此为模板，选用经设计与筛选得到的特异性核苷酸序列为引物进行PCR扩增，继而将产物进行琼脂糖凝胶电泳分析与凝胶成像系统检测，最终依据检测结果判别僵蚕的真伪和掺伪情况；通过本发明的方法判断样品是否为僵蚕伪品或掺伪品，操作简单、无需测序、专属性强、快速准确，在僵蚕样品真伪鉴定中具有独特的优势及重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法，属于中药鉴定领域。

背景技术

僵蚕，为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuilknt而致死的干燥体。多于春、秋季生产，将感染白僵菌病死的蚕干燥。僵蚕始载于《神农本草经》，应用历史悠久，咸、辛，平，归肝、肺、胃经，具有息风止痉、祛风止痛和化痰散结等功效。现代药理研究表明，僵蚕具有抗凝、抗惊厥、抗癌和镇静催眠等作用。

僵蚕是常见的中药动物药，疗效确实、药用价值高，年需求量在400吨以上，且常年外销出口。由于僵蚕的使用量较大，市面上出现了不少伪品或掺伪品，例如用石灰水将死家蚕掺白加工而成，或将绿僵菌感染致死的家蚕、黑死蚕等冒充正品使用，对僵蚕质量造成了不良影响，也给消费者带来了不可忽视的安全隐患。因此，采用合适的技术鉴别僵蚕的真伪是很关键的问题。

近年来，有学者运用分子生物学技术开展了对僵蚕的鉴定研究，例如基于COI序列和ITS序列的DNA条形码技术，主要利用动物基因组DNA提取试剂盒同时提取家蚕和白僵菌的DNA，然后分别扩增COI序列和ITS序列，并进行扩增产物测序，继而建立NJ类聚树分析，对鉴定同时含有动物和真菌的复合型药材起到了一定效果。但是，在普通PCR技术利用DNA序列进行物种的鉴定过程中，由于采用了通用引物，因此在完成扩增后，需要进行产物测序并与基因数据库比对，从而判断种属，步骤较多、耗时长、需要专门设备；此外，还无法实现对于掺伪品的检识，或者由于掺伪现象而影响鉴定结果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，本发明针对僵蚕正品以及常见伪品的物种设计特异性引物，并提供了利用特异性引物扩增技术鉴别僵蚕的方法。

该法操作简单、专属性强、鉴别快速、无需测序，能准确直观地鉴别僵蚕的真伪(包括掺伪)。本发明为僵蚕的专属性鉴定提供一条新的途径，有助于监控僵蚕药材的质量，从而有利于保障临床用药的安全性、有效性，具有重要的应用价值。

本发明通过以下步骤达到快速鉴定僵蚕真伪的目的：

本发明首先提供一组鉴定僵蚕的特异性引物，所述引物为PBM-1或PBM-2和PBB-1或PBB-2；PBM-1上下游引物如SEQ.ID.NO.1和2所示，PBM-2上下游引物如SEQ.ID.NO.3和4所示；PBB-1上下游引物如SEQ.ID.NO.5和6所示，PBB-2上下游引物如SEQ.ID.NO.7和8所示。

进一步的，在上述特异性引物鉴定过程中，若受试样品为完整的僵蚕且结果显示为阳性，则判断为正品僵蚕，若受试样品经切片或粉碎，为非完整的僵蚕(如碎片、粉末)且结果显示为阳性，则需进一步鉴定是否为掺伪品(含绿僵菌)。

所述鉴定僵蚕的特异性引物还包括引物PMA-1或PMA-2，PMA-1上下游引物如SEQ.ID.NO.9和10所示；PMA-2上下游引物如SEQ.ID.NO.11和12所示。

所述引物PBM-1或PBM-2均来自于家蚕(Bombyx mori)，PBB-1或PBB-2均来自于白僵菌(Beauveria bassiana)，并且引物PBM-1或PBM-2和PBB-1或PBB-2均能达到鉴定僵蚕的目的；引物PMA-1或PMA-2均来自于绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，并且均能达到鉴定僵蚕中是否掺伪含绿僵菌的僵蚕的目的。