[发明专利]谷氨酰胺合成酶基因以及应用

说明书

本发明提供了一种新的谷氨酰胺合成酶基因，其具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。本发明还提供了含有所述谷氨酰胺合成酶基因的真核表达载体。本发明提供的谷氨酰胺合成酶基因可用在GS基因扩增系统中促进目的蛋白的表达以及高表达细胞株的筛选。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的谷氨酰胺合成酶基因，以及该谷氨酰胺合成酶基因在真核表达载体构建中的应用。

背景技术

根据目的蛋白表达的时间差异以及表达过程是否需要添加筛选压力，可将表达系统分为瞬时表达系统和稳定表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入含有外源基因的表达载体后不添加筛选压力，收集细胞产生的蛋白，转染后的细胞随着分裂而逐渐丢失目的蛋白，不能持续长久的进行蛋白生产。稳定表达系统是指表达载体进入宿主细胞并经筛选压力选择培养，挑选筛选后的细胞进行蛋白生产，目的基因整合进细胞基因组，并随着细胞分裂，目的基因仍能稳定存在，可以持续长久地提供目的蛋白。由于稳定表达需经过压力选择甚至基因扩增等步骤，需要较长的时间且需要消耗相对多的人力。

近年，伴随着哺乳动物细胞培养技术的发展，提高了单克隆抗体以及其他重组蛋白的表达量。稳定细胞系的构建是重组抗体产业化制备的第一步。作为抗体产业上游关键技术，如何快速、高效建立生产细胞系，是抗体产业发展中的关键问题。

外源基因在哺乳动物细胞内的扩增是提高外源基因表达水平的重要策略之一。一般来讲，表达系统中的整个载体是由两个独立且连在一起的表达单元组成：外源基因表达单元和扩增基因表达单元。扩增基因往往亦为选择标记。二氢叶酸还原酶 (dihydrofolatereductase，DHFR)基因扩增系统和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase， GS)扩增系统是最常用的基因扩增选择系统。DHFR系统是将目的基因和DHFR基因同时或分别转染细胞后加入氨甲喋呤(methotrexate，MTX)加压扩增。GS系统是新近发展的更有效的扩增表达系统。细胞转染GS基因及目的基因后，谷氨酰胺合成酶利用细胞内的氨和谷氨酰胺，在缺乏外源谷氨酰胺的培养条件下，加入甲硫氨酸砜亚胺 (Methionine sulphoximine,MSX)进行扩增，达到提高目的基因表达水平的目的。与 DHFR系统相比，GS系统不需要进行繁琐的加压过程便可以得到高水平的表达量。

然而，现有的GS系统仍然存在表达效率不能满足生产要求以及高表达细胞株难以筛选的问题。

发明内容

在一方面，本发明提供了一种新的谷氨酰胺合成酶基因(本文中也称作GS16034基因)，其具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了一种真核表达载体，其含有所述谷氨酰胺合成酶基因。

在一个实施方案中，所述真核表达载体是通过将初始载体pcDNA3.1(+)位点2136-2931bp间序列替换为所述谷氨酰胺合成酶基因而得到。

在另一实施方案中，所述真核表达载体是通过以下步骤制备：

1)将初始载体pcDNA3.1(+)位点2136-2931bp间序列替换为mGS基因以获得中间载体pcDNA3.1-mGS，其中所述mGS基因具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；

2)将初始载体pcDNA3.1(+)位点232-819bp间序列克隆进所述中间载体pcDNA3.1-mGS的1252-1253bp位点之间，以获得载体pcDNA3.1-mGS-DGV；以及

3)将所述载体pcDNA3.1-mGS-DGV上mGS基因替换为所述谷氨酰胺合成酶基因。