[发明专利]用于检测六种曲霉的LAMP引物组合及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测六种曲霉的LAMP引物组合及其应用。本发明提供的引物组合，由序列1至序列36所示的36条引物组成。本发明提供的引物组合可应用于检测待测样本中是否含有烟曲霉和/或土曲霉和/或构巢曲霉和/或黄曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus。本发明提供的引物组合鉴定用于检测曲霉属6种曲霉，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测六种曲霉的LAMP引物组合及其应用。

背景技术

侵袭性真菌病(invasive fungal disease，IFD)又称侵袭性真菌感染(invasivefungal infection，IFI)、深部真菌感染(deep fungal infection,DFI)，是指真菌侵入人体组织、血液，在其中生长和繁殖，引起炎症反应，并导致组织损害、器官功能障碍的病理生理过程。近二三十年来，随着实体器官和造血干细胞移植、肿瘤化疗、免疫抑制剂等新技术在临床中的广泛应用，使侵袭性真菌病的发病率和病死率逐年升高，已日益成为导致住院患者死亡的主要原因之一。由于感染侵袭性真菌病多发于入住ICU，高龄，糖尿病，恶性血液系统疾病，念珠菌定植，侵袭性操作，应用抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂等人群中，其机体免疫力低下，重症死亡率高，因此对侵袭性真菌感染的早期检测及确定感染菌种有极为重要的意义。

曲霉菌病通常由曲霉(Aspergillus)导致，经常导致人肺部疾病或损害免疫系统。曲霉菌的孢子约2-5μM大小，易悬浮在空气中。多数人吸入孢子并不会感染疾病，但免疫能力低下或有肺部疾病的患者具有更高的感染率，引起感染或继发感染，如过敏性支气管曲霉菌病、过敏性曲霉鼻窦炎、曲霉瘤、慢性肺曲霉病、侵入性曲霉病、皮肤曲霉病等。2011年刘又宁等对中国1998年至2007年临床确诊的肺真菌病患者的多中心回顾性调查显示肺曲霉病为37.9％，排第一位。

现有的侵袭性真菌感染检测方法主要包括常规检查法和特殊检查法两种。其中常规检查法主要包括：1)真菌显微镜检，即直接涂片染色镜检；2)真菌培养鉴定；3)组织病理学检查。特殊检查法主要包括：1)血清学检查；2)分子生物学检查。其中常规检查法仍被视为确诊侵袭性真菌感染的基石，但其存在敏感度较低，操作繁复，阴性结果不能排除诊断，检测周期较长(通常需要几天到几周的时间)等问题，而导致延误病情及用药，增加死亡率等；血清学检测难以排除真菌某些属的种间抗原抗体交叉反应从而导致误判。相较前两种方法，分子生物学技术具有高特异性和高准确性的优点，并可从基因水平阐明真菌种群之间和中内的分类学关系，因而在近年来越来越得到广泛认可和应用。目前建立的相关分子学诊断方法有普通PCR方法、脉冲场凝胶电泳分型(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、实时荧光定量PCR技术(RTFQ-PCR)等，其共有的问题是对实验操作要求较高，检测时间较长(2.5h-3h)左右。因此，建立快速准确的分子诊断方法，为临床提供早期诊疗依据是解决现状的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测六种曲霉的LAMP引物组合及其应用。

本发明首先提供了引物组合，由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ、引物组Ⅴ和引物组Ⅵ组成；

所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；

所述引物Ⅰ-F3为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-B3为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；