[发明专利]用于EGFR基因突变检测的试剂盒及应用

说明书

本发明公开一种用于EGFR基因突变检测的试剂盒及应用，属生物技术和医学领域。与现有技术相比，本发明所提供的引物、探针和扩增体系的试剂盒检测灵敏度高，可检测突变含量低至0.1％的标本；检测准确率高，采用双控检测体系和锁核酸技术，保证检测结果的可靠性；仅需8个反应，包括EGFR质控反应液、L858R检测反应液、19del检测反应液、G719X检测反应液、L861Q检测反应液、3Ins20检测反应液、T790M检测反应液和S768I检测反应液，即可用于检测非小细胞肺癌患者的血清或血浆、组织样本中EGFR基因的29种常见突变型。

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，尤其涉及的是一种用于EGFR基因突变 检测的试剂盒及应用，包括EGFR基因突变检测的试剂盒及其引物、探针和扩增 体系。

背景技术

目前，肺癌己成为全球癌症死亡的首要原因，全球每年新发病例150万， 严重威胁人类健康。在肺癌患者中，非小细胞肺癌约(NSCLC)占80％，且就诊 时80％己失去手术或放射治疗最佳机会，致使其长期生存率低，疗效令人堪忧。 IIIB/IV期非小细胞肺癌2年生存率仅10％-20％，中位生存时间仅10-12月。因 此，人们需要不断研究新的治疗方法以提高肺癌治疗的有效率，其中以分子靶 向治疗为代表的新治疗方法，为晚期NSCLC的治疗带来了新的希望。

人类表皮生长因子受体(epidermal growth faCtor receptor，EGFR)是目前治疗最重要的分子靶点，其是原癌基因C-erbB-1(Her-1)的表达产物。该基因位于 人类7号染色体短臂7p12～14区，由28个外显子组成，该蛋白属于受体酪氨 酸激酶(TKI)家族，存在于所有正常上皮和部分间叶来源的细胞。EGFR可以激 活酪氨酸激酶，从而调控下游信号通路最终介导细胞分化、生存、迁移、侵袭、 黏附和细胞损伤修复等一系列过程，在肿瘤恶性生长中发挥重要作用。因此， EGFR成为肿瘤靶向治疗研究的一个重要靶点。

目前，EGFR的靶向治疗主要基于小分子酪氨酸激酶抑制(EGFR-TKI)和单 克隆抗体两种机制。其中，基于EGFR-TKI机制的吉非替尼(Gefitinib，商品名 易瑞沙)和厄洛替尼(Erlotinib，商品名特罗凯)，是目前肿瘤患者最有效的靶向药 物，但这些靶向药物并非对所有患者有效，EGFR敏感突变是药物有效的前提。 临床研究结果表明，吉非替尼对EGFR外显子18、19或21发生突变的患者， 有效率可达80％，而对野生型患者基本无效。目前已发现至少30种突变 EGFR-TKI药物反应性有关，主要是外显子19的缺失突变和外显子21的L858R突变。此外，研究表明部分EGFR-TKI类药物初始治疗有效的患者在后 期会发生耐药反应，这与EGFR20号外显子的突变密切相关，其中50％的 EGFR-TKI耐药由外显子20的T790M点突变所致。

EGFR基因的酪氨酸激酶区存在多种突变，其中29种为常见突变(见表 1)，主要集中在外显子18-21上，其中约90％存在于外显子19和21上，包括外 显子19上747-750位氨基酸之间的19种常见缺失突变约占突变的45％；外显 子21上的L858点突变约占突变的40％-45％，这些位点也是中国人EGFR基因 的热点突变。

大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一 起。因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA，所以对体细胞突变检测需要 较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临 床需要。特异性探针法如以Scorpions ARMS为代表的英国DxS和中国厦门Adx 的EGFR检测试剂盒虽然检测灵敏度高，但其检测费用较高，不适合国内NSCLC 患者的常规检测和筛查，因此，临床迫切需要开发一种快速准确、操作简便、 灵敏度高的检测EGFR基因突变的试剂盒，满足临床用药和检测诊断的时效性 要求。