[发明专利]快速制备桑格测序模板的方法

说明书

本申请提供了一种快速制备桑格测序模板的方法，包括：对包含环状DNA样本进行变性处理；对变性产物进行滚环扩增；用通过碱性磷酸酶处理滚环扩增产物去除其中残余的dNTP。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种快速制备桑格测序模板的方法。

技术背景

桑格(即Sanger)测序法，即双脱氧链终止法，是核酸测序的经典方法。其基本原理是在DNA聚合酶以测序靶DNA为模板合成互补链的反应体系中引入双脱氧核苷酸(ddNTP)，导致合成中的互补链在ddNTP对应的靶DNA核苷酸处终止，形成一系列链终止片段，再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将长度只差一个核苷酸的各DNA链终止片段区分开，根据各片段终点处ddNTP的种类判断靶DNA相应位置上的靶DNA核苷酸的种类。

目前，常规的桑格测序模板制备需要经过摇菌培养和质粒抽提(比如碱裂解法或商业小提试剂盒)两个步骤，共耗时约14小时。本领域对于改进桑格测序的模板样本制备过程，提供能缩短制备时间，同时保证测序效率的样本制备方法存在需求。

滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)技术可用于扩增环状DNA模板，例如质粒和噬菌体DNA，以供桑格测序。该技术是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环式的复制方法而建立的一种核酸扩增技术，它是在恒温条件下发生的一种DNA扩增技术。在RCA反应中，当有环状DNA模板和聚合酶时，通过DNA聚合酶的作用，以环状DNA为模板进行复制，最后形成一条与DNA模板互补的重复序列的DNA单链(Lizardi et al.,1998)。

RCA体系包括:(1)噬菌体phi29DNA聚合酶；(2)环状模板，目前RCA扩增的模板也可为线性；(3)引物为1个或者2个，也可以为多个，一般引物需要具有内切酶抗性。其中噬菌体phi29DNA聚合酶非常重要。它具有很高的链置换活性，无须模板分离就可进行70kb的链置换DNA合成，而且性能稳定，持续合成能力高，可持续数小时高效催化DNA合成，合成速度约为50bp/s。另外，phi29DNA聚合酶的纠错能力强，错误率与pfu酶相当，明显低于TaqDNA聚合酶。RCA是一种等温信号扩增方法，其线性扩增倍数为10⁵，指数扩增能力大于10⁹。RCA技术是一种痕量的分子检测方法，可用于极微量的生物大分子和生物标记物的检测和研究。现在该方法已经成功用于线性双链DNA，甚至是全基因组DNA的扩增(Esteban et al.,1993；Qian et al.,2003；Simison et al.,2006)。RCA技术以其独特的优势在基因检测、基因诊断、原位检测、免疫检测和微阵列固相检测等领域展现了极大的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一在于解决目前桑格测序模板制备周期较长的问题。

为解决该问题，在一个方面，本申请提供了一种快速制备桑格测序模板的方法，该方法包括：对包含环状DNA的样本进行变性处理；将变性产物与滚环扩增反应液混合，进行等温滚环扩增；通过碱性磷酸酶处理滚环扩增产物去除其中残余的dNTP。

在本申请的语境中，“变性”按照本领域对于核酸变性的通常含义理解。根据一些实施方案，变性处理包括在升高的温度下处理样品，随后在变性完成后，降低样品的温度。根据一些更具体的实施方案，通过将样本加热至大约95℃的温度3分钟来实施变性处理。根据一些更具体的实施方案，加热后将样品降温至4℃并保持。根据一些更进一步的实施方案，在变性处理的反应体系中加入用于滚环扩增的随机引物。在一些具体的实施方案中，随机引物的长度为7bp。不希望受限于任何理论，高温可保证初始模板DNA的充分释放，降温过程可让随机引物和环状DNA模板退火结合。通过在变性过程之前加入随机引物，与在变性过程之后加入随机引物相比，可以进一步改善通过滚环扩增的效果。