[发明专利]一种葡萄籽原花青素的提取方法

权利要求书

1.一种葡萄籽原花青素的提取方法，包括以下步骤:

1)葡萄籽预处理

选取无霉变的葡萄籽，放入清洗池中，用无菌水清洗3次，沥干或采用干燥的葡萄籽为原料，将干燥的葡萄籽在无菌水中浸泡2h，使其充分吸水，浸泡清洗后沥干；将沥干后的葡萄籽放入滚筒式碾压机中，使葡萄籽碾压通过1.0mm的碾压间隙，经过碾压机处理后葡萄籽成扁平形状，种皮被碾出几道裂缝，清晰可见胚乳渗出；

2)发酵葡萄籽制备

a)菌种活化:将黑曲霉菌种接种于经过无菌验证的含有土豆培养基的试管斜面或平板中，然后将接种后的斜面或平板在25～30℃条件下培养72h，获得活化黑曲霉菌种；

b)菌种一级扩培:取500mL的锥形瓶，每瓶加入预处理后的葡萄籽40g和面粉2g，以此作为培养基；将培养基进行湿热灭菌，灭菌条件为温度为121℃，时间为15min；当培养基温度降到25℃时，移至超净工作台中，接入活化后的菌种，在25～30℃恒温箱中培养72h，期间每12h摇动锥形瓶一次，制得一级扩培菌种；

c)菌种二级扩培:取碾压后的葡萄籽10kg，进行湿热灭菌，灭菌条件为温度为121℃，时间为15min，灭菌完成后当葡萄籽的温度降至25℃时进行接种，接种量为1％，菌种与发酵基质混匀后，平铺于灭菌过的发酵间进行恒温发酵，保持室内湿度为85％，共保温发酵培养48h，每隔12h进行翻拌一次，制得二级扩培菌种；

d)葡萄籽发酵:将预处理后的葡萄籽与菌种按质量比20:1的比例进行接种，翻拌混匀后平铺于灭菌过的发酵间中进行发酵，在温度为28℃，湿度为90％的条件下，发酵48h，期间每隔8h进行翻拌一次；

3)原花青素提取液制备

采用三级四罐式逆流提取方式，罐体编号为A、B、C、D，具体操作为，每罐加入发酵后葡萄籽50kg，将乙酸调pH为5.0的80％乙醇溶液200L加入到A罐中，在温度为75℃条件下搅拌浸提20min，获得浸提液A1，将A1储存，将相同量的溶剂加入到A罐中，在相同条件下搅拌浸提20min，获得浸提液A2；再将浸提液A2抽入到B罐中，在相同的浸提条件下浸提，获得浸提液B1，将B1储存，将相同量的溶剂加入到A罐中，在相同的条件下浸提，浸提完成后，获得浸提液A3和料渣，将料渣从A罐中清除，并向A罐中再加入50kg发酵葡萄籽，再将浸提液A3加入到B罐中，在相同条件下浸提，获得浸提液B2；将B2加入到C罐中获得浸提液C1，将C1储存，将浸提液加入到B罐中浸提，在相同条件下浸提，获得浸提液B3和料渣，清除B罐中的料渣，并向B罐中加入发酵葡萄籽50kg；将滤液B3加入到C罐中在相同条件下浸提，获得浸提液C2；将C2加入到D罐中在相同条件下浸提，获得浸提液D1，将D1储存，将溶剂加入到C罐中在相同条件下浸提，获得浸提液C3和料渣，清除C罐中的料渣，并向C罐中加入发酵葡萄籽50kg；将C3提取液加入到D罐中在相同条件下浸提，获得浸提液D2；将D2加入到A罐中，获得浸提液A1，将A1储存，按照上述方式循环进行提取，合并上述存储的提取液，离心过滤除去絮状沉淀，获得无沉淀液提取液；

4)原花青素粗提物

将无沉淀提取液进行减压蒸馏，条件为:60～80℃，真空度为0.06～0.08MPa，在此条件下蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液，将原花青素水溶液进行喷雾干燥，获得原花青素粗提取物；

5)原花青素精制

将AB-8大孔树脂分别用乙醇浸泡24h，用乙醇冲洗至流出液与蒸馏水混合无混浊现象，再用蒸馏水冲洗至流出液无乙醇味，将预处理后的吸附树脂进行装柱，层析柱径高比1:30，要求树脂均匀分散且无气泡，称取原花青素粗产品配制成浓度为2.5％水溶液，过滤除去不溶性杂质，对原花青素溶液进行过柱，用3倍柱体积为30％的乙醇溶液进行解吸，收集洗脱液减压蒸馏，获得原花青素水溶液标记为提取组分1，再用3倍柱体积60％的乙醇溶液作为洗脱剂进行解吸，收集洗脱液，减压蒸馏回收乙醇，获得原花青素将水溶液标记为提取组分2；

6)低聚原花青素制备

取原花青素水溶液提取组分2加入体积分数为10％的混合酸，混合酸由6％亚硫酸溶液和99.5％冰乙酸体积比0.8:1组成，在70℃条件下保温60min，用NaOH溶液调pH为6.0，并将原花青素水溶液与提取组分1进行混合，降温到4℃，低温滤去不溶物，混合后进行喷雾干燥，干燥条件进口温度为120℃，出口温度80℃获得原花青素提取物。