[发明专利]一种利用SOL技术和化学发光技术对血清miRNA标志物进行定量检测的方法

说明书

本发明涉及一种SOL（短链核苷酸连接）技术和化学发光技术对血清miRNA（microRNA）标志物进行定量检测的方法。所述方法首先对血清样本进行预处理、固定捕获序列于酶标板上，然后杂交核酸探针a和b、血清中的目标miRNA，再通过多次清洗可去除错配和部分互补的miRNA，最后利用信号放大序列和化学发光技术对血清中目标miRNA含量进行检测。本发明提供的方法无需提取血清中的miRNA且无需扩增目标miRNA，灵敏度高，特异性强，可满足临床检测需求。

技术领域

本发明属于血液游离核酸标志物检测方法与技术领域，更具体地，涉及一种利用SOL技术和化学发光技术对血清miRNA标志物进行定量检测的方法。

背景技术

miRNA(microRNA)是一类内源性、长19至24个核苷酸的非编码单链RNA分子。它主要通过碱基互补配对与指导蛋白质合成的信使RNA(messager RNA，mRNA)相结合，导致其翻译受阻或降解，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命。由于超过半数的miRNA在基因组上定位于与肿瘤相关的脆弱位点，故异常表达的miRNA与多种肿瘤的发生，分期，转移和复发有着密切关系。

由于miRNA在不同肿瘤中有其特定的表达模式，因此目前有很多研究将miRNA用于肿瘤的诊断和预后监测的分子标志物、治疗靶标及疾病分型的标志物。人体不同组织与细胞产生的miRNA通过与脂蛋白结合或集中于外泌体等细胞外囊泡内的两种方式进入血液。这两种方式保证了血液中的miRNA不受温度、酸碱度、以及核酸酶的影响，在外周血中稳定存在。这使得通过检测血清/血浆/全血中的miRNA标志物成为当下研究肿瘤的热点。例如：Chen等(Davoren P A,McNeill R E,Lowery A J,et al.Identification of suitableendogenous control genesfor microRNA gene expression analysis in human breastcancer.[J].BMC Mol Biol,2008,9(1):76)利用PCR技术检测了临床血清样本中的91种miRNA，分析比较后筛选出其中10种miRNA(miR-20a,miR-24,miR-25,miR-145,miR-152,miR-199a-5p,miR-221,miR-222,miR-223,miR-320)作为早期诊断非小细胞肺癌的生物标志物，其灵敏度和特异性达到96.6％和97.2％。越来越多的实验证据表明，miRNA在肿瘤诊断中有较高的灵敏度与特异性，可以作为肿瘤早期诊断的生物标志物。

但是，一般的荧光定量PCR技术仍然具有一些固有的缺陷，其中主要的缺点是：1、需要提取样本中的总miRNA；2、需要对提取的miRNA进行逆转录；3、由于miRNA的序列较短，需要用polyA加尾法或茎环结构的探针进行检测，增加了实验的成本和难度；4、检测时需要对目标miRNA进行扩增，难以满足临床检测的需要。

因此，开发一种灵敏度高、特异性强，且能满足临床检测需求的新型miRNA检测技术具有重要的研究意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有荧光定量PCR技术操作复杂，无法满足临床检测需求的缺陷，提供一种利用SOL技术和化学发光技术对血清miRNA标志物进行定量检测的方法。

本发明提供的方法无需提取血清中的miRNA，通过多次清洗可去除错配和部分互补的miRNA，提高定量检测方法的检测特异性；另外，使用化学发光技术放大目标miRNA的信号值，故无需扩增目标miRNA；灵敏度高、特异性强，可满足临床检测需求。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用SOL技术和化学发光技术对血清miRNA标志物进行定量检测的方法，所述方法包括如下步骤：

S1：对临床采集的血清样本进行预处理使其中miRNA游离，得血清样品预处理溶液，备用；