[发明专利]一种利用SOL技术和化学发光技术对血清miRNA标志物进行定量检测的方法

权利要求书

1.一种利用SOL技术和化学发光技术对血清miRNA标志物进行定量检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1：对临床采集的血清样本进行预处理使其中miRNA游离，得血清样品预处理溶液，备用；

S2：向酶标板中加入捕获序列溶液，震荡，混合均匀后于25~40℃震荡，将捕获序列固定在酶标板上，弃去溶液，除去多余未反应的捕获序列；所述捕获序列为NH₂-(CH₂)₁₂-GTTGTAAATTGTAGTAAAGAAGTA；所述酶标板含有可与-NH₂反应的基团；

S3：将S1中的血清样品预处理溶液、核酸探针a溶液和核酸探针b溶液加入至S2的酶标板中，震荡，混合均匀后，于40~50℃静置条件下杂交15~21h，弃去滤液，清洗至少3次；所述核酸探针a为：CAAACAAACATTCAAATATCAATC-与目标miRNA一半序列互补区域；所述核酸探针b为：与目标miRNA另一半序列互补区域-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC；

S4：将信号放大序列溶液加入至S3得到的酶标板中，混合均匀后，于40~50℃静置条件下杂交不低于2h，将信号放大序列与核酸探针b杂交；所述信号放大序列为：GATTGATATTTGAATGTTTGTTG，所述信号放大序列上修饰一个或多个生物素；

S5：向S4得到的酶标板中加入可与生物素反应的亲和素-过氧化物酶融合蛋白溶液，震荡混合均匀后，通过生物素-亲和素反应将亲和素-过氧化物酶融合蛋白杂交在所述信号放大序列上；

S6：向酶标板上加入可与过氧化物酶反应的化学发光底物进行化学发光检测，通过标准曲线即可得到miRNA的含量。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1中预处理为：将血液样品溶液与血清预处理液混合，于25~100℃下震荡反应60~120min；所述血清预处理液为Tween 20-TE缓冲液与Proteinase K的混合溶液，所述血清处理液与血清样品溶液的体积比不小于1:1。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述TE缓冲液的pH为8.0；所述血清预处理液中Tween 20的质量浓度不低于为1%；所述Proteinase K的浓度不低于为200 μg/ml。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述捕获序列通过酰胺反应固定在酶标板上。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述捕获序列溶液为捕获序列PBS缓冲液，所述捕获序列的浓度不低于1nM。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S3中核酸探针a溶液为核酸探针a TE缓冲液，核酸探针b溶液为核酸探针b TE缓冲液；所述缓冲液的pH为7~8，所述核酸探针a和b的浓度均不低于1nM。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S3中杂交时间为21h。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S4中信号放大序列上修饰的生物素的数量为1~4个。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S5中的亲和素-过氧化物酶融合蛋白为联霉亲和素-辣根过氧化物酶融合蛋白或亲和素-辣根过氧化物酶融合蛋白。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S6中化学发光底物为鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类与双氧水溶液中的一种或几种。