[发明专利]一种无创产前亲权鉴定方法及其试剂盒

说明书

本发明提供一种优化的无创产前亲权鉴定方法及试剂盒，所述方法包括如下步骤：(1)获取孕妇外周血样本；(2)密度梯度离心；(3)白细胞去除；(4)免疫荧光染色、固定封片、有核红细胞鉴定及捕获，获得单个有核红细胞；(5)进行偏向性单细胞扩增；(6)STR分型检测及亲权鉴定。本发明创造性地将密度梯度离心、免疫磁珠负选、免疫荧光、激光显微切割、单细胞扩增等优化的技术结合在一起形成系统鉴定方法，成功分离孕妇外周血中胎儿有核红细胞，并将其成功应用于亲权鉴定中。相对于现有技术，该方法更高效、更纯净、无创伤、简单、实用、精准、损失少、成本低、方法重复性好，拓展了亲权鉴定范围，同时提高了检测的精密度。

技术领域

本发明涉及亲权鉴定领域，尤其涉及一种无创产前亲权鉴定方法及其试剂盒。

背景技术

亲权鉴定是指通过医学和遗传学等手段判别父母与子女的亲权关系，目前常用的是应用STR进行鉴定。时代在进步，需求在多样化，针对胎儿进行产前亲权鉴定的需求日益增多。自从PCR技术应用到生物检测领域，尤其是应用到STR基因座进行分析后，DNA提取便成为亲权鉴定中DNA多态性分析的关键环节，而DNA样品质量的好坏将直接关系到后续实验的成败。

伴随高通量测序技术的快速发展，单核苷酸多态性(SNP)作为第三代遗传标记，越来越多地成为无创伤性产前亲权鉴定最新的检测手段。相对于STR，SNP在染色体中的分布更为广泛，数量更多，检测方法也更方便可靠。但这并不意味着二代测序技术能够即刻大范围应用于亲权鉴定：第一，目前二代测序的成本较高，不能被亲权鉴定应用广泛接受；第二，二代测序平台都不可避免地存在一定比例的错误率，技术解决方案还未完全成熟完整，达不到DNA数据库引入要求；最后，二代测序解读规则尚未制定，不能应用于全国实验室数据共享范围。因此，对已有STR数据库的充分应用成为目前无创伤性的产前亲权鉴定最经济实惠的检测方案。

传统有创伤性的产前诊断技术如羊水穿刺、绒毛穿刺等由于需要从胎儿组织取样从而具有较高的流产风险，对母体和胎儿造成危害，尤其是对于高龄产妇而言更加严重。所以无创伤性产前诊断技术成为当今研究热点。胎儿有核红细胞(Fetal Nucleated RedBlood Cells，FNRBC)是一种单核细胞，于孕6周至分娩后几个月内持续存在于母体外周血中，细胞生命周期短、含有胎儿基因的全部遗传信息、便于遗传学和分子生物学分析。因此被认为是最好的产前诊断材料，从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞为无创伤性产前亲权鉴定开辟了新途径。

近年来，许多研究都致力于胎儿有核红细胞的富集。但是由于胎儿有核红细胞在孕妇外周血中的数量极少，通常孕妇外周血中胎儿有核细胞与孕妇有核细胞的比例约为1：10⁶，高效率和高纯度的分选一直是一个难题，从而导致DNA抽提困难，达不到检测输入量而影响STR扩增鉴定。

为了解决这一问题，本发明涉及一种更佳的改进的无创产前亲权鉴定方法及其试剂盒，可以高效率和高纯度地成功分离胎儿有核细胞，同时创造性地将单细胞(pg，皮克)级的样本总量扩增至常规STR鉴定需要的纳克级(约150-150000个细胞DNA量)，整个流程无需纯化及转管即可进行STR鉴定，同时可以防止纯化及转管带来的样本损失或污染，从而使得样本损失更小，污染更少。

同时为了解决单细胞扩增偏向性的问题，本发明同时提供了一种改进优化的单细胞扩增方法，通过调节引物设计及配比，对定向区域片段进行相对富集，降低扩增偏向性，保证STR检测的成功率及准确度。

本专利创造性地将密度梯度离心、免疫磁珠负选、免疫荧光、激光显微切割、单细胞扩增等改进优化的技术有机结合在一起形成系统鉴定方法，成功分离孕妇外周血中的胎儿有核红细胞，并将其成功应用于亲权鉴定中。相对于现有技术，该方法更高效、更纯净、无创伤、简单、实用、精准、损失少、成本低、方法重复性好，拓展了亲权鉴定的范围，同时提高了检测的精密度。

发明内容