[发明专利]一种miRNA超敏检测用探针液体芯片的制备及应用

权利要求书

1.一种miRNA超敏检测用探针液体芯片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1，LNA探针序列修饰：miRNA捕获探针序列引入锁链核酸LNA，所述miRNA捕获探针序列的末端修饰了双硫键，即得含双硫基序列修饰的LNA探针序列溶液；

S2，纳米金属阵列排布：所述纳米金属阵列由将贵金属加工成带有纳米尺寸尖端或间隙的结构阵列排列组成所述纳米金属阵列按照固定行间距和列间距分布排列，所述行间距范围为50～1000nm，所述列间距范围为50～1000nm；

S3，LNA探针序列双硫基还原：将步骤S1制备的含双硫基序列修饰的LNA探针序列溶液与3（2-羧乙基）膦盐酸盐TCEP溶液混合后，将LNA探针中的双硫基还原成巯基，即得含巯基的LNA探针序列溶液；

S4，LNA探针锚定：所述步骤S3含巯基的LNA探针序列溶液加入步骤S2制备得到的纳米金属阵列上，室温静置反应至少1小时后，用去离子水冲洗干净，即得LNA探针。

2.根据权利要求1所述的一种miRNA超敏检测用探针液体芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中所述的锁链核酸LNA捕获探针序列长度为18～25个核苷酸。

3.根据权利要求1所述的一种miRNA超敏检测用探针液体芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中所述的纳米金制备步骤如下：

S'1，纳米金属刻模：板材表面上旋涂光刻胶，所述光刻胶通过电子束曝光蚀刻出图形，所述图形呈镜像对称，并显影、定影，即得纳米阵列模具；

S'2，金属溅射成型：所述步骤S'1的纳米阵列图案上依次真空溅射一层金属钛和一层贵金属；

S'3，光刻胶剥离：通过溶剂剥离光刻胶步骤,所述步骤S'2中沉积在光刻胶上的金属层随光刻胶一起剥离，沉积在石英或玻璃基底上的金属镀层则得到保留,即得纳米金属图案保留在板材表面上。

4.根据权利要求3所述的一种miRNA超敏检测用探针液体芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤S'1所述的板材的材质为石英或透明玻璃。

5.根据权利要求3所述的一种miRNA超敏检测用探针液体芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤S'2中所述钛层厚度范围为3～5nm，所述金层厚度范围为20～40nm。

6.根据权利要求1所述的一种miRNA超敏检测用探针液体芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中所述LNA探针序列溶液加入过量的三（2-羧乙基）膦盐酸盐TCEP溶液混合，所述LNA探针序列溶液浓度≥10μmol/L，所述三（2-羧乙基）膦盐酸盐TCEP溶液浓度≥10μmol/L。

7.一种miRNA快速超敏检测用探针液体芯片的检测方法，其特征在于：采用权利要求1-6中任一项所述的LNA探针，

测试样品溶液通过1个或多个微流道滴加到预埋在每个微流道内的LNA探针阵列上，并扫描滴加在LNA阵列上的样品的吸收光谱。

8.根据权利要求7所述的一种miRNA快速超敏检测用探针液体芯片的检测方法，其特征在于：所述的吸收光谱的测量采用透射谱测量方法进行扫描。

9.根据权利要求8所述的一种miRNA快速超敏检测用探针液体芯片的检测方法，其特征在于：所述透射谱测量法采用线偏振光源扫描滴加在LNA阵列上的样品吸收光谱。

10.根据权利要求7至9任一项权利要求所述的一种miRNA快速超敏检测用探针液体芯片的清洗再生方法，其特征在于：所述LNA探针测试使用后置于氢氧化钾溶液和双氧水混合溶液中加热至50～65℃，恒温浸泡1小时，所述氢氧化钾溶液浓度为40～60mmol/L，所述双氧水浓度为20%～30%，所述氢氧化钾与双氧水混合比例为1:2～1:3。