[发明专利]绵羊B4GALNT2基因全长序列的扩增及其表达量的检测

权利要求书

1.绵羊B4GALNT2基因，其特征在于，其核苷酸序列或其反义核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种绵羊B4GALNT2基因的扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)经体外培养3天的绵羊颗粒细胞通过RNA提取试剂盒提取其总RNA，并分别按照Takara公司的Prime Script RT reagent Perfect Real Time试剂盒和SMARTer RACE 5’/3’Kit User Manual试剂盒说明书合成普通cDNA模板、5’cDNA第一链模板和3’cDNA第一链模板；

(2)利用步骤(1)所获得的普通cDNA为模板，以6对扩增引物，通过普通PCR方法扩增B4GALNT2基因的各保守区序列；

所述6对扩增引物如下：

上游引物F1：ACCACTCCTTCAGCCTAGTG；

下游引物R1：TCATCGTCCACCCAGAGAAC；

上游引物F2：CAGACTGAACTCCCTGCGGTGA；

下游引物R2：CACATCCAGTTCGGTCTTCTC；

上游引物F3：AAGATTGAGGTGCTGGTGGA；

下游引物R3：TGCCCTGATCAGTGATTGGT；

上游引物F4：CAGCCCTGGAGAAGACCTAC；

下游引物R4：CCCACGCTCTGATCCTCTAA；

上游引物F5：CTTGAGGAAGTGGCAGTCTG；

下游引物R5：GCCACTGCGCTTACAAAGTA；

上游引物F6：ATGGGATGCAAGAAGGTGGA；

下游引物R6：TTTTGACCTACCGTGGCTGT；

(3)利用步骤(1)所获得的5’cDNA第一链为模板，以5’GSP1和5’GSP2为扩增引物，通过降落PCR方法扩增B4GALNT2基因的5’端序列；

5’GSP1：AGAGGCTCTTGATGTGTTTCTCAGGGAG；

5’GSP2：CCCAGGGCCAAGAATAAGACGGACATC；

(4)利用步骤(1)所获得的3’cDNA第一链为模板，以3’GOP为扩增引物，通过降落PCR方法扩增B4GALNT2基因的3’端序列，再以所获得的降落PCR产物为模板，以3’GIP为巢式引物，进行巢式PCR扩增；

3’GIP：TGGGATGCAAGAAGGTGGAGGGCAGAG；

3’GOP：GATTCTCCCACTGCTGCGCTGCCTTTT；

(5)上述步骤(2)、(3)和(4)中最终所获得的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，均经切胶纯化后连接到pMD18-T载体，转化到DH5α感受态细胞中，挑选阳性质粒，再通过琼脂糖凝胶电泳鉴定获得所需目的条带，通过Sanger测序得到绵羊B4GALNT2各保守区序列、5’端序列和3’端序列片段信息；

(6)将步骤(5)中扩增得到B4GALNT2的各保守区序列、5’端序列和3’端序列片段通过DNAMAN软件进行序列拼接，得到绵羊B4GALNT2基因mRNA全长序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的普通PCR扩增程序为：95℃、5min，33×[95℃、30s，退火温度、30s，72℃、45s]，72℃、8min，4℃保存。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的降落PCR扩增程序为：95℃、5min，10×[95℃、30s，72-0.4℃、30s，72℃、3min]，25×[95℃、30s，68℃、30s，72℃、3min]，72℃、8min，4℃保存。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的降落PCR扩增程序为：95℃、5min，10×[95℃、30s，72-0.4℃、30s，72℃、3min]，25×[95℃、30s，68℃、30s，72℃、3min]，72℃、8min，4℃保存；步骤(4)中的巢式PCR扩增程序为：95℃、5min，25×[95℃、30s，68℃、30s，72℃、3min]，72℃、8min，4℃保存。