[发明专利]一种新的脓毒症动物模型的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物医学模型领域，尤其是涉及一种新的脓毒症动物模型的制备方法。

背景技术

脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合症，发病率居高不下，而且该病患者极易并发多脏器功能障碍。脓毒症发病机制复杂，涉及炎症反应、内皮损伤、凝血障碍等一系列问题，是危重症监护病房患者死亡的头号杀手，欧美等国每年有数十万人死于脓毒症。建立标准化的脓毒症动物模型，是探索严重全身性感染、感染性休克和多器官功能障碍综合症的病理生理学机制和防治措施的需要。

研究人员已经建立了多种脓毒症动物模型，可以复制临床脓毒症患者的一些症状及实验室检查结果。这些模型大致分为感染模型、血管内输注细菌模型、内毒素中毒模型。通过改变细菌/内毒素的注射剂量、注射方式（腹腔/静脉等）等，研究人员可以对脓毒症发病后的血流动力学改变、血清炎症因子水平变化、肝肺肾等脏器病理学变化进行研究，进而了解脓毒症发病的可能机制。盲肠结扎穿孔（CLP）模型是目前研究脓毒症及脓毒性休克应用最广的一种模型。采用该模型进行脓毒症治疗药物的开发，有些药物动物实验阶段显示了较好的疗效，然而在后续Ⅱ期及Ⅲ期临床试验中，并没有得到预想的效果，有些甚至会加重疾病。造成这一现象的重要原因之一即是现有脓毒症动物模型不能很好的模拟人类脓毒症发病的自然过程。

临床研究发现，脓毒症的发病率与年龄密切相关，年龄每增加十岁，脓毒症的发病率呈指数增长，65岁以上人群中罹患脓毒症的患者是65岁以下患者的13.1倍，而老年人脓毒症高发与其机体免疫功能降低有着密切关系。以往建立脓毒症动物模型，选用动物均为年轻、健康的动物，与临床实际相偏离，这导致了动物模型研究的成果难以在临床脓毒症治疗中得到应用。因此，如何建立更加贴近临床脓毒症发病过程的实验动物模型，是脓毒症基础研究和治疗药物开发急需解决的问题。本发明以30g左右的成年小鼠，经多次免疫抑制后模拟免疫功能低下的状态，建立了一种新型脓毒症模型，为深入研究中老年脓毒症患者的发病机理以及开发临床治疗药物提供了新的模型材料。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种新的脓毒症动物模型的制备方法，从而解决上述问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新的脓毒症动物模型的制备方法，采用SPF级8周龄Balb/c小鼠，体重25-30g，适应性饲养1周后，进行实验，其特征在于，包括如下步骤；

步骤一：适应性饲养及造模阶段，小鼠自由进食进水，采用12h间隔的光照/黑暗交替照明，温湿度适宜，将60只符合标准的Balb/c小鼠进行标记，雌雄各半，每只小鼠对应的序号固定且唯一。采用随机数字表法将其均分为雌性、雄性2个大组，每个大组又分为A（n＝6）、B（n＝8）、C（n＝8）、D（n＝8）4个小组；

步骤二：A组：对照组，在各个注射时间点，给予与药物和（或）细菌体积相同的生理盐水；

步骤三：B组：环孢素A注射组：在第-5天、-3天、-1天，称重各只小鼠，按5-30mg/kg体重的剂量给予环孢素A腹腔注射，在第0天，给予与细菌体积相同的生理盐水腹腔注射；

步骤四：C组：细菌注射组：在第-5天、-3天、-1天，称重各只小鼠，给予生理盐水腹腔注射，在第0天，每只小鼠腹腔注射重悬于生理盐水的0.5-5×10⁹cfu细菌；

步骤五：D组：环孢素A＋细菌组，在第-5天、-3天、-1天，称重各只小鼠，按5-30mg/kg体重的剂量给予环孢素A腹腔注射，在第0天，每只小鼠腹腔注射重悬于生理盐水的0.5-5×10⁹cfu细菌；

步骤六：标本采集：各组动物，于第0天注射细菌或生理盐水，注射第12h开始，观察动物的生存状态，在小鼠毛发直立、腹部体温变低、触动没有反应时，摘除眼球取血并分离血清；脱颈处死小鼠，快速分离小鼠的肝、肾、肺、脾等组织，生理盐水漂洗两次，吸水纸吸去残留缓冲液后，将组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定。

步骤七：各组小鼠血清指标检测及病理分析：对小鼠血清，利用ELISA法检测血清炎症因子含量；利用生化分析仪检测小鼠肝、肾组织损伤指标；各组小鼠的肝、肾、肺等器官的石蜡切片经HE染色后，显微镜下比较组织损伤情况。

作为本发明的一种优选技术方案，所述环孢素A注射剂采用适量环孢素A粉末，溶于生理盐水中，配成2mg/mL环孢素A注射液，超声波混匀后，于-20℃分装备用。

作为本发明的一种优选技术方案，所述环孢素A的注射剂量为10mg/kg体重。