[发明专利]一种新的脓毒症动物模型的制备方法

权利要求书

1.一种新的脓毒症动物模型的制备方法，采用SPF级8周龄Balb/c小鼠，体重25-30g，适应性饲养1周后，进行实验，其特征在于，包括如下步骤；

步骤一：适应性饲养及造模阶段，小鼠自由进食进水，采用12h间隔的光照/黑暗交替照明，温湿度适宜，将60只符合标准的Balb/c小鼠进行标记，雌雄各半，每只小鼠对应的序号固定且唯一；

采用随机数字表法将其均分为雌性、雄性2个大组，每个大组又分为A（n＝6）、B（n＝8）、C（n＝8）、D（n＝8）4个小组；

步骤二：A组：对照组，在各个注射时间点，给予与药物和（或）细菌体积相同的生理盐水；

步骤三：B组：环孢素A注射组：在第-5天、-3天、-1天，称重各只小鼠，按5-30mg/kg体重的剂量给予环孢素A腹腔注射，在第0天，给予与细菌体积相同的生理盐水腹腔注射；

步骤四：C组：细菌注射组：在第-5天、-3天、-1天，称重各只小鼠，给予生理盐水腹腔注射，在第0天，每只小鼠腹腔注射重悬于生理盐水的0.5-5×10⁹cfu细菌；

步骤五：D组：环孢素A＋细菌组，在第-5天、-3天、-1天，称重各只小鼠，按5-30mg/kg体重的剂量给予环孢素A腹腔注射，在第0天，每只小鼠腹腔注射重悬于生理盐水的0.5-5×10⁹cfu细菌；

步骤六：标本采集：各组动物，于第0天注射细菌或生理盐水，注射第12h开始，观察动物的生存状态，在小鼠毛发直立、腹部体温变低、触动没有反应时，摘除眼球取血并分离血清；脱颈处死小鼠，快速分离小鼠的肝、肾、肺、脾等组织，生理盐水漂洗两次，吸水纸吸去残留缓冲液后，将组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定；

步骤七：各组小鼠血清指标检测及病理分析：对小鼠血清，利用ELISA法检测血清炎症因子含量；利用生化分析仪检测小鼠肝、肾组织损伤指标；各组小鼠的肝、肾、肺等器官的石蜡切片经HE染色后，显微镜下比较组织损伤情况。

2.根据权利要求1所述的一种新的脓毒症动物模型的制备方法，其特征在于，所述环孢素A注射剂采用适量环孢素A粉末，溶于生理盐水中，配成2mg/mL环孢素A注射液，超声波混匀后，于-20℃分装备用。

3.根据权利要求1所述的一种新的脓毒症动物模型的制备方法，其特征在于，所述环孢素A的注射剂量为10mg/kg体重。

4.根据权利要求1所述的一种新的脓毒症动物模型的制备方法，其特征在于，所述细菌为生物工程领域常用大肠杆菌克隆菌株DH5α，细菌经LB培养基培养扩增后，离心收集，经PBS缓冲液洗涤后重悬至适当的浓度备用。

5.根据权利要求4所述的一种新的脓毒症动物模型的制备方法，其特征在于，所述DH5α的注射剂量为1×10⁹cfu/只小鼠。

6.根据权利要求1所述的一种新的脓毒症动物模型的制备方法，其特征在于，4%多聚甲醛溶液采用40g多聚甲醛溶于900mL蒸馏水，调整pH在7.4左右（±0.05），用蒸馏水定容至1000mL，常温避光保存。

7.根据权利要求1所述的一种新的脓毒症动物模型的制备方法，其特征在于，所述标本采集主要包括小鼠血清、肝、肺、肾、心脏等组织的采集。

8.根据权利要求1所述的一种新的脓毒症动物模型的制备方法，其特征在于，血清学指标检测，主要包括血清TNF-α、IL-6，采用ELISA法检测各组小鼠血清炎症因子的表达水平。

9.根据权利要求1所述的一种新的脓毒症动物模型的制备方法，其特征在于，所述小鼠肝、肾组织损伤指标，主要包括谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮。

10.根据权利要求1所述的一种新的脓毒症动物模型的制备方法，其特征在于，病理分析，主要包括各组小鼠的肝脏、肺脏、肾脏组织的病理变化，采用苏木素-伊红染色观察组织结构。