[发明专利]一株生产原儿茶酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本方法公开了一株生产原儿茶酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。其通过在产3‑脱氢莽草酸的大肠杆菌中表达3‑脱氢酶莽草酸脱水酶(aroZ)进而可生产原儿茶酸。该菌株可以利用葡萄糖无机盐培养基发酵生产原儿茶酸，降低了培养基成本，从而降低了原儿茶酸的生产成本，且上述重组菌株不含质粒，遗传性稳定。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及生产原儿茶酸重组大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与 应用。

背景技术

原儿茶酸(protocatechuate,PCA)具有抗菌、平喘、祛痰、解蛇毒等部分功效，有收敛和促 进伤面愈合的作用。在临床上可用于治疗慢性气管炎、烧伤、小儿肺炎、菌痢、急性盂肾炎、急 性胰腺炎及某种溃疡病的治疗。它还应用于医药、有机中间体、材料与染料合成，以及饲料、食 品、环保等领域。PCA可通过来源于克雷伯氏肺炎球菌(Klebsiellapneumoniae)的3-脱氢莽草 酸脱水酶(3-dehydroshikimate dehydratase，aroZ)作用于3-脱氢莽草酸(DHS)一步催化形成(图 1)，同时它也是儿茶酚(Catechol)、没食子酸(Gallate)、已二酸(Adipate)等一系列重要 化工产品的重要前体物(Li K,FrostJW.Synthesis of vanillin from glucose.Journal of the American ChemicalSociety,1998,120:10545-10546；Draths KM,Frost JW.Environmentally compatiblesynthesis of catechol from D-glucose.Journal of the American ChemicalSociety,1995, 117:2395-2400；Draths KM,Frost JW.Environmentally compatiblesynthesis of adipic acid from D-glucose.Journal of the American ChemicalSociety,1994,116:399-400)。利用3-脱氢莽草酸 (DHS)合成原儿茶酸可以避免有毒的苯和甲苯等原料的使用，减少对人体和环境影响。

Pugh等以Escherichia coli NST74为出发菌株，通过定点突变筛选到aroF基因的突变子 aroF^FBR，该基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶酪氨酸反馈抑制得到解 除。敲除分支酸的竞争途径pheA基因，突变菌株命名为E.coli NST74，最终得到的大肠杆菌工 程菌E.coli NST74/pUbiC-PobA能在适当的IPTG添加策略下以葡萄糖为原料发酵72h，上清液 中积累442mg/L的PCA(Shawn Pugh,Rebekah McKenna,MarwanOsman,et al.Rational engineering of a novel pathway for producing thearomaticcompounds p-hydroxybenzoate,protocatechuate,and catecholinEscherichia coli.Process Biochemistry,2014,49:1843-1850.)。