[发明专利]新型的甘油单-二酰酯脂肪酶

说明书

本申请提供了新的具有甘油单‑二酰酯脂肪酶活性的多肽，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在上述序列中包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加的序列。本申请还提供了编码所述多肽的多核苷酸、含有该多核苷酸的表达载体和宿主细胞。此外，本申请还涉及上述具有脂肪酶活性的多肽的用途。

发明领域

本申请属于酶工程领域，具体地，涉及具有脂肪酶活性的多肽、其编码核酸，以及包含所述编码核酸的表达载体和宿主细胞。本申请还涉及上述多肽的筛选方法及其用途。

发明背景

脂肪酶是酯酶的一种，可以催甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、其它小分子酯、多元醇酯和多元酸酯酯键的水解，脂肪为脂肪酶的天然底物，水解的过程中会产生甘油二酯和甘油单酯，水解最终产物为甘油和脂肪酸。脂肪酶水解条件温和，副产物少，不需要辅酶。脂肪多为疏水物质，因此水解反应发生在油水界面或者有机相中。甘油单-二酰酯脂肪酶(MDGL)是脂肪酶的一种，MDGL具有底物特异性，仅作用于甘油单酰酯(MAG)和甘油二酰酯(DAG)，对甘油三酰酯不起催化作用，可以利用酯化或转酯化反应来生产具有较高工业价值的甘油单酰酯。

MAG是一种优良的乳化剂，在食品、医药和化妆品工业中有广泛的应用。MAG的传统合成工艺是在高温下，以无机碱为催化剂，在氮气条件下通过油脂/甘油三酯(TAG)与甘油连续酯化进行生产，产物为MAG、DAG和TAG的混合物，通过蒸馏获得MAG，MAG的产率为40-50％。与传统合成工艺不同，酶法合成MAG是以脂肪酸和甘油为底物，在温和条件下催化合成MAG，酶法催化中脂肪酸的转化率超过97％，MAG在产物中的占比超过74％。目前限制酶法应用的主要问题是酶的活力较低和酶的成本较高。

发明概述

第一方面，提供了具有甘油单-二酰酯脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，其中由(b)获得的多肽变体仍保持甘油单-二酰酯脂肪酶活性。

在一实施方案中，本申请的多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，上述多肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。在本文中，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的多肽被命名为MDGL-new。

第二方面，提供了编码第一方面的多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在上述序列中包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加的序列；以及

(b)在严格条件下与a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在一实施方案中，本申请的多核苷酸其包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在优选的实施方案中，上述多核苷酸由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。

第三方面，提供了表达载体，其包含至少一种第二方面的多核苷酸。

在某些实施方案中，本申请的表达载体还包含调节多核苷酸表达的调控序列，其中多核苷酸与调控序列可操作地连接。在优选的实施方案中，所述表达载体为质粒载体，例如P0586-G50。

第四方面，提供了包含第二方面的多核苷酸或第三方面的表达载体的宿主细胞。在具体的实施方案中，宿主细胞为酵母例如毕赤酵母、或者大肠杆菌。

第五方面，提供了第一方面的多肽在制备甘油单酰酯中的用途。

第六方面，提供了合成甘油单酰酯的方法，其包括将第一方面的多肽与脂肪酸和甘油进行接触。

第七方面，提供了筛选本申请的多肽的方法，其包括：