[发明专利]促红细胞生成素的等电聚焦电泳方法

说明书

本发明公开了促红细胞生成素的等电聚焦电泳方法，其是使用BIO‑RAD 111型电泳仪进行等电聚焦电泳，其中，每5mL制胶配方包括：25wt％丙烯酰胺单体溶液1mL、10.5M尿素3.33mL、60wt％蔗糖0.412mL、40wt％pH 2～4两性电解质溶液0.183mL、40wt％pH 3～10的两性电解质溶液0.075mL，最后加入预先混合的催化剂溶液0.1wt％FMN‑Na 25μl+10wt％AP7.5μl+TEMED 1.5μl；加样前先预电泳：200V，10min；电泳程序：第一阶段50V，30min；第二阶段100V，60min；第三阶段200V，30min；第四阶段450V，60min；第五阶段590V，直到电流为0。本发明方法可以将促红细胞生成素的不同等电点的电荷异构体分离开来，且对上限电压要求不高，不需要设备附加冷却装置。

技术领域

本发明属蛋白质电泳技术领域，更具体地说，本发明涉及可以分离促红细胞生成素的电荷异构体的等电聚焦电泳方法。

背景技术

人体中的促红细胞生成素(Erythropoietin，简写EPO)是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。它是一种含唾液酸的酸性糖蛋白，造血细胞因子超家族成员之一。未分化的干细胞分化成红细胞系干细胞，促红细胞生成素在此发挥作用，使之变为前成红细胞。对进一步再成熟为成红血细胞、网织红细胞，血红蛋白的合成以及流入末梢血管等均有促进作用。一般在贫血和低氧状态时，根据身体组织对氧的需要，促红细胞生成素的供给量将增加，但在肾脏贫血时其含量则非常低。服用红细胞生成素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度(即增加血液中红细胞百分比)。1989年第一个重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)制剂Epogen获美国食品药品监督管理局(FDA)批准。rHuEPO主要用于治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血、癌症及骨髓衰竭导致的贫血、失血后贫血等。

在某一pH的溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH值称为该氨基酸或蛋白质的等电点。等电聚焦电泳的原理是两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的pH值有关。带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的pH值使相应的蛋白质不再带电)时，电流达到最小，不再移动。

EPO的等电聚焦电泳的方法介绍：

《中华人民共和国药典》2015年版三部0541电泳法第六法等电聚焦电泳法中的第二法与重组人促红素注射液(CHO细胞)中的“3.1.7等电聚焦”介绍了利用水平电泳槽对EPO进行等电聚焦电泳的方法，其主要内容如下：

1.仪器装置：恒压或恒流电源、带有冷却装置的水平电泳槽和制胶模具。

2.主要试剂

(1)A液：称取丙烯酰胺29.lg、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至100mL，双层滤纸滤过，避光保存。

(2)B液：10％过硫酸铵溶液，临用前配制。

(3)标准品：所选用的标准品的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。

(4)固定液：称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g,加水溶解并稀释至300mL。

(5)脱色液(平衡液)：取95％乙醇500mL、冰醋酸160mL，加水稀释至2000mL。

(6)染色液：称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g，加脱色液300mL，在60～70℃水浴中加热，使溶解。

(7)保存液：取甘油30mL，加脱色液300mL，混匀。

(8)正极液(0.5mol/L磷酸溶液)：量取磷酸50mL，加水至1800mL。