[发明专利]重组精氨酸脱亚胺酶及其产业化制备方法和应用

说明书

本发明提供了重组精氨酸脱亚胺酶及其编码基因、制备方法、应用。本发明针对大肠杆菌表达系统对编码基因、载体、菌株、制备工艺及缓冲体系都进行了全面的优化及筛选，相比密码子优化前，优化后的精氨酸脱亚胺酶编码基因重组表达获得的精氨酸脱亚胺酶表达量和活性都有了大幅提高。同时，本专利通过对重组精氨酸脱亚胺酶重组菌发酵工艺的优化，可稳定获得高产量及活性的目的蛋白。此外，本专利还提供了体系优良的重组精氨酸脱亚胺酶酶活测定系统，真实的反应了重组蛋白的酶活。体外活性表明，本专利提供的重组精氨酸脱亚胺酶可有效抑制多种肿瘤细胞的生长，具有广阔的药用前景及产业化生产可能性。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及重组精氨酸脱亚胺酶(以下简称rADI)及其编码基因、产业化制备方法和应用。

背景技术

精氨酸是人体的一种非必需氨基酸，可以经尿素循环获得，而精氨酸缺陷型肿瘤因缺少ASS(Argininosuccinate Synthetase)所以细胞无法合成精氨酸，因此其生长需要从外部环境中摄取精氨酸。经研究表明，精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,EC3.5.3.6，简称ADI)能够降解环境中的精氨酸，从而抑制这些精氨酸缺陷型肿瘤的生长，达到杀死癌细胞治疗癌症的目的。这种新型的“精氨酸剥夺疗法”可以用于某些精氨酸营养缺陷型癌细胞的治疗，例如肝癌细胞和黑素瘤细胞。在这之前，已经有类似的“饥饿疗法”用于一些肿瘤的治疗中。

ADI广泛存在于细菌和真核细胞内，自从1933年F.Horn首次报道了绿脓假单胞菌(Pesudomonas pyocyaneum)中含有ADI后，之后很多来源于不同微生物的ADI相继被报道，其中包括假单胞菌、支原体、盐杆菌和乳球菌等。来源于不同微生物的ADI在酶活及性质方面差别较大，最适反应pH范围在5.6到7.6之间，大多数在酸性范围内；分子量范围从47kDa到199kDa，多为同源二聚体，部分为同源四聚体；比酶活范围从5.4到140.27U/mg。

大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的外源蛋白表达系统，具有成本低、产量高、易放大等特点。虽然目前已有采用大肠杆菌表达系统进行ADI重组表达的相关文献，例如刘咏梅等人的《精氨酸脱亚胺酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化》，但是现有文献公开的方法其产量和活性基本还达不到产业化制备ADI的要求。

为了获得更高的蛋白体积收率研究人员开发了高密度发酵方法，但在高密度发酵过程中由于菌体密度较高往往会导致发酵复合培养基成本高、DO控制困难等问题。针对这些问题，菌株构建、发酵过程的控制、发酵培养基的筛选就显得尤为重要。

此外，使用大肠杆菌作为外源蛋白的表达宿主时，由于蛋白在大肠杆菌中的过表达、宿主自身匮乏的蛋白翻译和修饰以及蛋白表达条件等多种因素导致过表达蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在。蛋白的包涵体形式表达具有：表达量高、纯度高、降低下游纯化成本的特点。同时，一般而言包涵体是一种无活性的蛋白聚集体，需要进行人工复性才能获得相应的生物学功能。而包涵体的复性是一个非常复杂的过程，不仅与蛋白质复性的过程控制密切相关，还很大程度上取决于目的蛋白的自身性质。如果复性条件不适宜将会出现分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又易产生沉淀析出，影响得率。

发明内容

本专利要解决的3个技术层面的问题是：1、构建符合药用蛋白要求的rADI大肠杆菌表达菌株，实现蛋白的高效表达；2、开发产量高、成本低廉、易于放大的rADI大肠杆菌菌株高密度发酵工艺；3、开发获得纯度高、活性好的rADI变复性及纯化工艺。

本发明目的之一在于提供一种构建rADI的重组大肠杆菌表达菌株的方法，该方法包括：针对大肠杆菌表达系统的ADI基因密码子优化、表达载体构建和表达菌株构建。具体来说就是：

本发明提供了一种rADI，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。