[发明专利]一种高纯度多杀菌素的提取方法

权利要求书

1.一种高纯度多杀菌素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）发酵液预处理：发酵结束后放罐前，加入1%硅藻土混均，用3~5 mol/L的氢氧化钠溶液调节发酵液pH=11.5，然后将发酵液加热升温至45°C，保温并以450r/min速度搅拌处理12小时；（2）用板框压滤机进行压滤，进行固液分离，收集菌丝体，收集菌丝体用90%极性有机溶剂进行充分溶解并用HCL溶液调节pH值至3.5搅拌运行，浸泡抽提菌丝体中的多杀菌素；用板框压滤机进行压滤，再次进行固液分离，收集浸提清液；（3）用纯水稀释收集浸提清液至有机溶剂溶度至60%，通过大孔吸附树脂进行产物吸附，用65%-75%%的极性有机溶剂将大孔树脂中吸附的多糖蛋白等杂质进行梯度洗脱，用90%的极性有机溶剂将大孔树脂中吸附的多杀菌素产物进行解析，45°C条件下真空浓缩，挥发除去极性溶剂，得到多杀菌素浓缩液；（4）用NaOH溶液调节pH值=11，搅拌1小时静置12小时使多杀菌素沉淀，过滤，用PH=10的稀碱液将多杀菌素沉淀洗涤1~3次，在45°C下真空干燥24小时，即得到90%以上多杀菌素粉剂粗品；（5)用多杀菌素粉剂粗品重量2倍1：1极性溶剂与纯水的混合剂溶解多杀菌素粉剂粗品并用3~5 mol/L的磷酸溶液调节pH值至5.0上层析柱进行等度洗脱，分部收集98%以上多杀菌素纯品，用旋转蒸发器在45°C真空下脱除洗脱剂中的极性溶剂，用低介电常数或高碳醇萃取溶媒进行萃取，得到负载多杀菌素有机相，萃取条件为：萃取溶媒与多杀菌素浓缩液体积比=1:1~5，温度20~45°C，pH=5.0~7.0，萃取时间5~10min；萃取完成分层后，收集负载有机相；（6）将负载有机相中加入纯水进行反向萃取，反萃取条件为：负载有机相与纯水体积比=1~5:1，纯水PH=6.0~6.5，温度20~30°C，反萃取时间5~8 min，反萃取级数为1~5；反萃取分层完成后收集反萃取相；将含有多杀菌素收集的反萃取相进行45°C真空旋蒸，脱除多余水分，形成油膏状。

2.将脱除多余水分的多杀菌素油膏浓缩物放置-86°C冻干机进行冷冻干燥即得到99%以上高纯多杀菌素粉剂。

3.根据权利要求1所述的第（2），（3），（4），（5）步中，所述极性溶剂为丙酮；第（3）步中，所述大孔吸附树脂为HZ-818；第（5）步中，所述层析柱为高径比10，柱的体积为上样1g多杀菌素设计柱体积为200ml第（5）步中，所述层析柱洗脱剂为丙酮：水：磷酸，体积比为649:350：1；第（5）步中，所述低介电常数萃取溶媒为乙酸丁酯；所述高碳醇萃取溶媒为正辛醇；

根据权利要求1所述的收集菌丝体用90%极性有机溶剂进行充分溶解多杀菌素的工艺，其特征在于，所述第（2）步，发酵菌丝体与极性有机溶剂体积比=1:1.5，浸泡温度为30~35°C，搅拌时间8小时。

4.根据权利要求1或2所述的用多杀菌素粉剂粗品重量2倍1：1极性溶剂与纯水的混合剂溶解多杀菌素粉剂粗品并用3~5 mol/L的磷酸溶液调节pH值至5.0上层析柱进行等度洗脱工艺，其特征在于，所述第（4）步，层析柱洗脱剂为丙酮：水：磷酸，体积比为649:350：1，柱温为常温25~30°C，洗脱剂总量为层析柱体积的4~6倍，层析速率为4BV/h；

5.据权利要求1所述的第6步萃取溶媒与多杀菌素浓缩液体积比=1:3，萃取温度30°C，萃取pH=6.5，萃取时间8 min。