[发明专利]VP2基因和NP基因重组腺病毒及其应用

说明书

本发明提供了一种VP2基因和NP基因重组腺病毒及其应用，从IBDV和AIV的SD株中分别扩增出VP2基因和NP基因，将获得的目的基因克隆到穿梭载体pDC₃₁₅‑MCS‑EGFP中，利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒pDC₃₁₅‑VP2‑NP‑EGFP与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得含有VP2基因和NP基因的重组腺病毒pBH‑VP2‑NP‑EGFP。该重组腺病毒可以刺激机体产生抗体，用琼扩法测定IBDV抗体含量达到有效抗体水平，血凝抑制试验方法测定AIV抗体含量均显著优于对照组pBH‑EGFP；攻毒试验结果表明，保护率达到90％。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，进一步涉及重组病毒的构建技术，具体涉及VP2基因和NP基因重组腺病毒及其应用。

背景技术

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursaldisease virus，IBDV)引起的禽类急性、高度接触性免疫抑制性传染病，主要侵害鸡的中枢免疫器官法氏囊，从而导致免疫抑制，增加了机体对其它病原体的易感性，降低对其它疫苗的反应性。该疾病发病率高，病程较短，发病鸡主要表现为腹泻、颤抖、极度虚弱严重者引起死亡,对养殖业的危害巨大，而且幼鸡感染之后可导致免疫抑制，诱发多种疫苗免疫失效。该病毒为双链RNA病毒，有单层衣壳，无囊膜。IBDV病毒颗粒有五种蛋白构成，其中VP2蛋白是IBDV的构象保护性抗原，可以诱导产生具有保护性的中和抗体，VP2中和抗体可以引发机体对于法氏囊强毒攻击的保护。

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属甲型流感病毒，主要引起禽类呼吸系统疾病、产蛋下降及高死亡率等症状的急性传染病。AIV的亚型众多，容易发生基因突变和重排，给禽流感免疫造成很大的困难。该病毒为单股负链RNA，包含8个独立的RNA片段，其中核蛋白(NP)具有种群和型特异性，能产生具有交叉保护作用的抗体和细胞免疫反应，其高度保守，在固定毒株与野毒株之间变异较小。

目前市场上的疫苗以弱毒苗和灭活苗为主，但是它们存在着免疫持续时间短且可能会诱导潜伏感染等弊端。基因工程苗安全有效，克服了弱毒苗和灭活苗的不足；此外，二联苗还可以减少对动物免疫接种时的应激并节约成本，达到一苗多防的目的。因此，构建表达IBDV VP2基因和AIV NP基因的重组活载体疫苗具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供VP2基因和NP基因重组腺病毒及其应用，以解决现有技术中缺乏一种此类重组病毒构建方法的技术问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种VP2基因和NP基因重组腺病毒，是由以下方法制备的：

1)从IBDV中扩增出VP2基因；从AIV的SD株中扩增出NP基因；

2)将获得的目的基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP；

3)将重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGlox E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP。

作为优选，步骤1)中VP2基因的扩增包括以下操作：以序列为SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的DNA片段分别作为正向引物和反向引物，以IBDV的总RNA为模板，RT-PCR扩增获得VP2基因。

作为优选，步骤1)中NP基因的扩增包括以下操作：以序列为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4的DNA片段分别作为正向引物和反向引物，以AIV的RNA为模板，RT-PCR扩增获得NP基因。