[发明专利]一种7β-羟基类固醇脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及应用

说明书

本发明公开了一种来源于马赛梭菌(Clostridium Marseille)的7β‑羟基类固醇脱氢酶、编码基因、载体，以及其在生物催化制备熊去氧胆酸中间体3,12‑二酮‑7β‑胆烷酸中的应用，所述7β‑羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列如SED ID NO:1所示；本发明提供了一种立体选择性制备3,12‑二酮‑7β‑胆烷酸的新7β‑羟基类固醇脱氢酶；通过该7β‑羟基类固醇脱氢酶可制备熊去氧胆酸中间体3,12‑二酮‑7β‑胆烷酸；本发明中所述3,12‑二酮‑7β‑胆烷酸制备方法具有光学纯度高、条件温和、环境友好等优点，具有较高的工业化应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种7β-羟基类固醇脱氢酶及应用，特别涉及一种重组7β-羟基类固醇脱氢酶、编码基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及该酶或含有该酶的重组细胞为催化剂在制备熊去氧胆酸中间体3,12-二酮-7β-胆烷酸中的应用。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)是名贵中药熊胆粉所含的主要有效成分，是一种来自熊胆的次级胆汁酸，由初级胆汁酸经细菌代谢生成，在临床上主要用于治疗胆结石疾病以及各种急慢性肝病，具有良好的治疗效果。中药熊胆粉主要从人工养殖的熊中以“活熊引流取胆”的方式提取，这有违野生动物保护法，而且UDCA收率低，无法满足市场需求，因而人工合成UDCA具有重要意义。下表提供了合成步骤中重要化合物的结构式、化学名称和缩写。

经典的化学法制备UDCA工艺以胆酸(CA)为原料，共需要7步反应制得UDCA。由于化学氧化是非选择性的，CA上的羧基和3α、7α-羟基必须通过反复保护和脱保护，而且7-酮-石胆酸(7-keto-LCA)的催化加氢步骤选择性低，工艺路线冗长，导致收率较低。此外，中间产物7-keto-LCA的还原用到金属钠或者Pd/C催化氢化，选择性低，工业化放大生产不容易控制且不安全。

基于酶法制备UDCA的工艺主要有3条，如下所示：

Sun B等(Sun B,Kantzow C,Bresch S.Biotechnology and bioengineering,2013,110:68-77)描述了一种化学酶法制备UCDA的工艺(路线a)。首先利用化学法氧化CA制备DHCA，之后通过睾丸酮丛毛单胞菌(Comanomonas testosteroni)的3α-HSDH和产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)的7β-HSDH将DHCA还原成12-keto-UDCA，最后通过wolff-kishner还原反应获得最终产物。在1L反应体系中利用上述两酶催化0.1mol/L DHCA制备12-keto-UDCA，最终反应收率达到99.5％。Monti D等(Monti D,Ferrandi EE,ZanellatoI,Hua L,Polentini F,Carrea G,Riva S.Advanced SynthesisCatalysis,2009,351:1303-1311)描述了另一条由CA出发制备UDCA的化学酶法工艺(路线b)。首先利用脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的7α-HSDH和商品化12α-HSDH(Genzyme Biochemicals Ltd.)氧化CA制备7,12-二酮-3α-胆烷酸(7,12-dione-3α-CA)，之后通过Clostridium absonum的7β-HSDH将7,12-dione-3α-CA还原成12-酮-熊去氧胆酸(12-keto-UDCA)，最后通过wolff-kishner还原反应获得最终产物。此路线中涉及到3个可逆反应的控制，难度较大，文献报道以CA为出发底物经由路线b制备12-keto-UDCA反应收率最高仅为73％。