[发明专利]一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物及其应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物及其应用。本发明所述基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，是根据AIV的H5型N1、N2、N6基因序列设计的引物，该引物体系可特异性的对H5N1、H5N2、H5N6型病毒进行特异性检测。并且本发明基于上述特异性引物，进一步优化建立了适宜于快速准确进行AIV检测的等温扩增基因方法体系，能够快速准确的对AIV病毒进行检出，该方法的最低检出病毒量为0.1LD₅₀，灵敏度与传统RT‑PCR一致，且该方法操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的快速诊断。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物及其应用。

背景技术

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的一种急性传染病，被世界动物卫生组织列为A类疾病，我国更将其列为一类动物疫病，给养禽业造成巨大经济损失。甲型流感病毒根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原的差异，将血凝素(HA)分为16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶(NA)分为9个亚型(N1-N9)，不同亚型的病毒根据上述分类予以命名。

AIV病毒的常用检测方法包括血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)、琼脂扩散试验、逆转录-环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)、以及RT-PCR法等。上述方法中，HI、琼脂扩散试验等方便虽然检测快捷，但该方法的敏感性较低，通常不适宜于微量病毒的检测；ELISA以及荧光抗体法的检测技术较为成熟，但其敏感性仍然低于RT-PCR方法。RT-PCR方法用于检测AIV病毒具有检测结果敏感性高的优点，但是常规RT-PCR检测必须经过变性、退火、延伸至少三个步骤，不仅过程较为繁琐，而且需要特殊的基因扩增仪器，检测便捷性较差。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。英国公司TwistDxInc以此为基础开发的核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测，这无疑能大大加快基因扩增的速度。并且该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。此外，由于不需要特殊的温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测，利用RPA技术进行AIV病毒不同亚型的特异性检测，也成为代替RT-PCR检测技术的理想方法。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，并进一步公开了一种基于RPA技术的AIV核酸检测方法。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，所述引物包括：特异性扩增位于AIV HA5型基因的第127-671位点之间片段的引物H5，以及特异性扩增位于NA1型基因的第1033-1460位点之间片段的引物N1，和/或特异性扩增位于NA2型基因的第825-1051位点之间片段的引物N2，和/或特异性扩增位于NA6型基因的第873-1197位点之间片段的引物N6。

进一步的，所述的基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，所述引物包括：

上游引物H5-F：5’-ACACATGCYCARGACATACT-3’；

下游引物H5-R：5’-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3’；以及，

上游引物N1-F：5’-TGTGGTCCRRTGTCCYYTAACG-3’；

下游引物N1-R：5’-TACTTGTCAATGGTGAATGGCAACTC-3’；和/或，

上游引物N2-F：5’-AGCCCRYTGTCAGGAAGTGC-3’；