[发明专利]酶法制备(2S;3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷

说明书

本发明通过基因工程技术分别构建了表达羰基还原酶SEQ ID NO:1、葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3和醇脱氢酶SEQ ID NO:5的大肠杆菌，表达该羰基还原酶的大肠杆菌和表达该葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌的组合、或者表达该羰基还原酶的大肠杆菌和表达该醇脱氢酶的大肠杆菌的组合能够对底物(S)‑N‑叔丁氧羰基‑3‑氨基‑1‑氯‑2‑酮‑4‑苯基丁烷进行联合催化，得到高光学纯度的(2S,3S)‑N‑叔丁氧羰基‑3‑氨基‑1‑氯‑2‑羟基‑4‑苯基丁烷，适用于工业化生产。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及通过羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶的联合催化、或者羰基还原酶与醇脱氢酶的联合催化来制备(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷的方法。

背景技术

HIV-1蛋白酶抑制剂是治疗AIDS的首先药物，FDA批准的几乎所有该类药物(除了替拉那韦(Tipranavir))都是拟肽类蛋白酶抑制剂，比如沙奎那韦(Saquinavir)、奈非那韦(Nelfinavir)、安普那韦(Amprenavir)、福沙那韦(Fosamprenavir)、地瑞那韦(Darunavir)。HIV-1蛋白酶是由HIV基因编码的天冬氨酸蛋白酶，通过水解多聚蛋白而得到成熟和有活性的酶以及结构蛋白，在HIV病毒复制过程中起到关键作用。蛋白酶抑制剂模拟多聚蛋白裂解部位构型，与多聚蛋白体竞争性结合蛋白酶，从而抑制HIV-1蛋白酶的活性，达到抑制HIV病毒复制的目的。这些拟肽类蛋白酶抑制剂的核心结构都是环氧化氨基苯丁烷，在其诸多合成路线中，由式I所示化合物(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷立体选择性还原为式II所示化合物(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷是关键的一步。

然而，化学法还原需要使用昂贵的手性催化剂，反应条件苛刻，并且反应步骤多，收率低，还存在产物的光学纯度低等缺点，近些年来，生物酶法催化还原逐渐成为有吸引力的方法并有一些文献报道。比如文献Emmanuelle,A.Highly stereoselectivebiocatalytic reduction of alpha-halo ketones.Tetrahedron:Asymmetry(2009)报道了采用CRED C1A来还原(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷，得到(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷，de可达到100％，但转化率最高只有58.3％。因此，开发催化性能更好的羰基还原酶和转化工艺，以获得更高的底物投料浓度、更高的转化率具有很必要。

发明内容

为了克服现有技术的不足，得到酶活性更高的催化体系，发明人对羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶和醇脱氢酶进行了大量的筛选和构建，发现这些酶中一些特定氨基酸序列的酶之间的组合可以获得更高的底物化合物I投料浓度和更高的转化率。基于该发现，发明人还对于酶促转化条件进行了优化，从而创造出最优联合催化体系。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种制备(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷的方法，包括如下步骤：

以(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷为底物，用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的羰基还原酶或者其表达微生物、和氨基酸序列为SEQ ID NO:3的葡萄糖脱氢酶或者其表达微生物进行联合催化而得；或者

以(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷为底物，用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的羰基还原酶或者其表达微生物、和氨基酸序列为SEQ ID NO:5的醇脱氢酶或者其表达微生物进行联合催化而得。其中，

羰基还原酶SEQ ID NO:1为：